低氧条件下鼻息肉细胞中HIF-1α基因对VEGF表达的影响

鼻息肉是耳鼻咽喉科常见病、多发病，其主要病理特征为嗜酸性粒细胞浸润[1]，鼻息肉的病程迁延不愈，并且容易反复发作，严重影响患者的生活质量。至今，鼻息肉的发病机制尚不明确。近年来发现许多细胞因子参与了鼻息肉的发生和发展，其中缺氧诱导因子-1α（Hypoxic inducible growth factor，HIF-1α）和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）对鼻息肉的发生、发展起到了重要的作用。

HIF-1α是细胞缺氧条件下产生的一种转录因子，可以介导十多种靶基因的转录[2]。VEGF是强有力的血管通透因子，以往的许多学者研究认为，鼻息肉的水肿组织是由血管内皮生长因子引起的，并且大量的研究证明VEGF在鼻息肉组织中的过度表达与血管生成、上皮组织增殖及息肉组织复发密切相关。其他学者的前期实验已经证明，在低氧培养的鼻息肉细胞中，存在着HIF-1α和VEGF的高表达。本研究将继续探讨在低氧培养的鼻息肉细胞中，RNA干扰HIF-1α基因后VEGF的表达情况，进一步明确在鼻息肉细胞中HIF-1α和VEGF的相互关系。

1 资料与方法

1.1 收集标本：随机选取佳木斯大学附属第一医院2012年至2014年耳鼻喉科手术切除的鼻息肉组织标本，术后所有标本经病理科诊断证实为鼻息肉组织，并且查看病例保证所有患者术前未使用过激素类药物进行治疗。

1.2 方法

1.2.1 原代细胞培养：在超净台中，取出术后的鼻息肉组织，放到含有双抗（100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素）的磷酸盐缓冲液中。然后在PBS中将组织反复冲洗、浸泡，并将组织剪碎，转移入新的培养瓶中，加入2.5 g/L胰酶，4℃条件下消化16～18 h；轻轻吹匀消化后的黏膜组织，使细胞脱落；将细胞悬液加入胎牛血清以中和胰蛋白酶的消化作用，离心弃上清，沉淀液中加入10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco′s modified eagle′s medium，DMEM）培养液（含有 F12和双抗），放入37℃、5%CO2、100%湿度的细胞培养箱中培养。

1.2.5 RNAi干扰HIF-1α：将5μL小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）加入250μL无血无抗的培养基中混匀，室温静置5 min；同时将5μL脂质体2000加入250μL相同的培养基中中混匀，室温静置5 min；然后将上述二者溶液混合均匀，室温静置20 min。将细胞接种于6孔板培养皿，待细胞生长至60%～70%时，即可用于转染。转染前先换液，换入1.5 mL的DMEM细胞培养液，再加入上述的siRNA混合液，4～6 h后给细胞换液，加入正常的细胞培养液，培养48 h后收样。HIF-1α-siRNA序 列 ：HIF-1α -siRNA1： 正 义 链 为 5′-CGGCGAAGUAAAGAAUCTGAATT-3′，反意链为 5′-UUCAGAUUCUUUACUUCGCCGTT-3′；HIF-1α-siRNA2： 正 义 链 为 5′-CCGCUGGAGACACAAUCAUAUTT-3′，反义链为 5′-AUAUGAUUGUGUCUCCAGCGGTT-3′。

鼻息肉是一种慢性炎症性疾病。其主要的病理特征有两个，一个是高度水肿的息肉组织，另外一个是大量的新生血管，这些新生的血管对于鼻息肉的生长和组织水肿的发生有着密切的关系。

应对身份假冒的最有效的方式就是身份认证。通过对无线通信中的双方或一方身份进行认证来保障网络资源与服务访问用户的真实性和有效性。无线通信网络中的身份认证主要包括移动用户身份认证和网络端身份认证两种。其中，移动用户身份认证主要是确保访问用户的合法性，避免非法用户身份假冒问题的出现；网络端身份认证主要是对网络端身份进行认证，避免攻击者假冒网络端欺骗用户。

1.3 统计学处理：应用GraphPad Prism统计软件进行数据分析，采用单因素方差分析和配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

1.2.4 实时定量PCR检测mRNA的表达：按Trizol试剂盒说明书提取鼻息肉细胞中总RNA，应用引物进行实时PCR反应合成cDNA；实时PCR扩增基因引物序列：HIF-1α的上游引物为 5′-GCACAGGCCACATTCACGTATAT-3′，下游引物为5′-GGTTCACAAATCAGCACCAA GC-3′；磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH） 的上游引物为 5′-AGGCTGGGGCTCATTTGCAG-3′，下游引物为 5′-TGGTGGTG CAG GAGGCATTG-3′。

为了让教学设计的高立意在课堂中落实，让学生的脑子动起来就成为了必须．如果我们强调思维的高立意，而学生却因为没有思维的原料和载体不能开展思维，那么再高的立意只能成教者的一厢情愿．正如爱因斯坦所说“一个空洞的头脑是不能进行思维的”一样，我们必须让学生的脑子里有足够思维的材料，怎么办？“低起点”是实现这一目标的必然策略，通过低起点的设计，可让绝大部分学生头脑不再空洞，可让同学们的大脑有足够加工的原料，如此难度的教学设计，课堂后气氛却如此活跃，不能不说是低起点的功劳．

1.2.3 Western blot法检测蛋白的表达：用6孔板培养细胞至底面积的90%以上，弃掉细胞培养液，用4℃预冷的PBS反复清洗细胞3次，每孔加入细胞裂解液100μL，冰上静置5 min后，刮取细胞至离心管中，继续冰上静置30 min，然后在4℃条件下12 000 r/min离心15 min，取上清液转移入新的离心管中；然后根据蛋白定量制备蛋白样品进行电泳，并根据所要检测蛋白大小选择不同浓度的凝胶。100 V恒压条件下转膜60 min；50 g/L脱脂奶粉封闭1 h；4℃条件下进行一抗杂交过夜。第二天洗膜后室温下进行二抗杂交1 h，洗膜，然后进行显色和成像分析。

2 结果

2.1.2 Western blot法检测HIF-1α蛋白的表达：转染 HIF-1α-siRNA1和 HIF-1α-siRNA2 后，HIF-1α的蛋白表达显著性下降（P＜0.05），详见图2。

2.1.1 实时PCR检测HIF-1αmRNA干扰效果：HIF-1α-siRNA1和 HIF-1α-siRNA2的干扰效果有统计学意义（P＜0.05），详见图 1。

2.1 HIF-1α的siRNA干扰效果

2.2 Western blot法检测siRNA瞬时干扰HIF-1a后VEGF的表达结果：HIF-1a的干扰效果与阴性对照组相比较，HIF-1a蛋白的表达显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；HIF-1a干扰的同时，VEGF的表达也呈现显著性下调（P＜0.05），详见图3。

1.2.2 低氧培养细胞：将培养生长至90%的鼻息肉细胞，换新鲜的培养液后，放入含有1%O2孵箱中培养，分别提取总RNA和细胞蛋白，用于real-time PCR和western blot检测。

  

图1 Real-time PCR检测干扰HIF-1α后HIF-1α的mRNA表达水平

  

图2 不同siRNA序列干扰后HIF-1α蛋白的表达

 

注：a：western blot表达结果；b：灰度值分析图

  

图3 siRNA瞬时干扰HIF-1a后VEGF的表达结果

 

注：a：western blot检测 HIF-1α、VEGF 的表达结果；b：HIF-1α 表达灰度值分析图；c：VEGF 表达灰度值分析图

3 讨论

这次研究所作的分析都是基于CGSS2005的调查数据的，此外我在这次研究中主要应用了OLS回归分析，通过OLS回归分析来分析各个自变量和因变量社会距离之间的关系。此外，在分析自变量的时候，还运用到了因子分析。

在临床上比较多见的肠道恶性肿瘤要属直肠癌,当前发病率已经呈现不断上升的态势,通过外科手术做永久性乙状结肠造口,即人工肛门。受到结肠造口的影响,患者往往发生控便能力障碍、外观改变、散发异味等不良情况,对生活造成极大的影响,造成较大的心理压力。因此应该积极提升患者的自我护理能力,减少患者的社会交往障碍[1]。本次研究针对本院实施结肠造口手术之后的患者开展护理干预,分析其对患者自我护理能力提升的效果。

VEGF参与血管的生成，是血管内皮细胞生成的启动者。经研究表明有多个基因可以调控VEGF的表达[3]，但是认为HIF-1a是其中最重要的基因。组织细胞在低氧刺激下大量表达HIF-1α和VEGF，VEGF可以增加血管的通透性，从而导致了血浆的外细胞外液增多，进而细胞外基质大量蓄积，促使组织发生水肿。并且VEGF可以引起血管扩张，使微血管发生渗漏，腺体分泌增加，从而加速了炎症的发生。

为了深入的研究鼻息肉细胞中HIF-1a和VEGF的表达相关性，本研究运用siRNA技术，沉默了HIF-1a基因，结果发现VEGF的表达出现了显著性下调。此结果进一步证实了缺氧条件下鼻息肉细胞中HIF-1a基因调控了VEGF的表达。

综上所述，沉默HIF-1a基因会导致VEGF表达的下调，说明RNA干扰技术（siRNA）是一种被广泛应用的基因治疗手段，在未来的发展中，HIF-1α或许有望成为鼻息肉治疗的靶点。

无论是从胎儿到成人，从生食到高汤，还是从促进消化到潜在地降低盐、糖摄入所引发的慢性病……鲜味一直陪伴在你我左右，无需恐鲜拒鲜。

参考文献

［1］ Lee TH，Nam JG，Lee HM，et al.Dexamethasone induces apoptosis of nasal polyp-derived tissue cultures through JNK and p38 MAPK activation［J］.Clin Exp Otorhinolaryngol，2014，7（2）：112-118.

［2］ 杨琳红，董震.地塞米松对人鼻黏膜上皮细胞前炎性因子表达的抑制作用［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科，2008，15（2）：93-97.

［3］ Ou KX，Liang J.Association of clinicopathologic parameters with theexpression of inducible nitric oxide synthase and vascular endothelial growth factor inmucoepidermoid carcinoma［J］.Oral Dis，2011，17（6）：590-596.