AMPK在七氟烷致H4细胞凋亡中的作用研究

七氟烷（Sevoflurane，Sev）作为吸入麻醉药，由于具有诱导迅速、苏醒快等特点，被广泛应用于儿童的全身麻醉手术。但其应用的最大问题是可能会引起认知功能损伤。研究表明，部分接受七氟烷麻醉的婴幼儿，智力发育会出现迟缓，甚至障碍，给家庭带来痛苦的同时，也增加了社会负担［1］。目前吸入麻醉药引起神经毒性的机制研究主要集中在以下三个方面：钙离子平衡失调，炎症以及氧化应激所致的线粒体损伤［2］。H4人脑神经胶质瘤细胞（H4 human neuroglioma cells，H4 cells）常被用于吸入麻醉药细胞毒性研究的细胞模型［3-5］。研究表明，吸入麻醉药可以引起H4细胞的氧自由基（ROS）显著上升，同时导致线粒体膜通透性发生变化，线粒体膜电位（MMP）下降，最终引起H4细胞凋亡［4］。AMP活化蛋白激酶（AMPK）是丝氨酸/苏氨酸激酶，它在维持细胞和整个身体的能量平衡中发挥关键作用［6］。AMPK是细胞能量感受器，当低血糖、营养匮乏、氧化应激、缺氧等消耗ATP的情况出现时，AMPK被激活，进而促进细胞摄取葡萄糖，保护线粒体完整性，增加线粒体的生物活性，促进ATP的合成。因此，AMPK在多种疾病中充当保护性因子，当细胞受到伤害时反应性升高。AMPK的研究主要集中在肥胖、糖尿病、衰老以及神经退行性疾病上。然而，AMPK在吸入麻醉药致细胞凋亡中的作用仍不清楚。因此，本实验通过建立七氟烷致H4细胞凋亡的模型，探讨AMPK是否参与了七氟烷引起的细胞损伤，为研究吸入麻醉药神经毒性提供新的靶点和思路。

1 材料与方法

1.1 材料 H4人脑神经胶质瘤细胞由孙逸仙纪念医院麻醉科林道炜教授惠赠。AMPK激动剂二甲双胍（Metformin，Met）购于美国 MedChem Express公司，AMPK抑制剂Compound C（CC）购于美国Sigma-Aldrich公司。AMPK、pAMPK、full-length caspase-3以及caspase-3 fragment抗体购于美国Cell Signaling Technology公司。建立细胞模型时使用的气体分析仪购于美国Datex-Ohmeda公司）

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1.2 实验方法 （1）建立吸入麻醉药细胞凋亡模型：将H4细胞以50万/孔的密度接种到6孔板中，过夜。待细胞贴壁后将6孔板置于连有进、出气孔的密闭容器中。进气孔与七氟烷挥发罐相连，通过输送气体管道将4.1%的七氟烷、95%的空气以及5%的二氧化碳输入容器中。出气孔与气体分析仪相连接，持续检测容器内七氟烷浓度。待充气完毕后，容器密封并置于37℃培养箱6 h。造模结束后，再次确认容器内七氟烷浓度为4.1%。其中，Metformin组在造模前1 h加入10 mM的二甲双胍，CC组在造模前30 min加入15 uM的Compound C。（2）蛋白质免疫印迹（Westernblot）：将20 ug的蛋白样品加到SDS-PAGE胶的上样孔中进行电泳，完成后通过电转转移到硝酸纤维膜上。用5%脱脂牛奶封闭1 h，随后加入相关一抗在4℃孵育过夜。其中，AMPK，p-AMPK，full-length caspase-3 and caspase-3 fragment的一抗浓度均为1∶1000；β-tubulin的一抗浓度为1∶10000。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行统计学处理。所有的数据均以（±s）表示，采用Student’s t-test进行两组间数据的比较，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

七氟烷能显著增加H4细胞的磷酸化AMPK（pAMPK）的表达（P＜0.05）；用AMPK激动剂二甲双胍预处理H4细胞，pAMPK水平比七氟烷组进一步升高（P＜0.05）；相反，若用AMPK抑制剂Compound C预处理，pAMPK水平显著下降（P＜0.05），详见图1。七氟烷能增加H4细胞caspase-3-fragment的表达量（P＜0.05），提示细胞凋亡增加；同时，用二甲双胍预处理H4细胞能显著减少caspase-3的激活（P＜0.05）；而Compound C则进一步增加七氟烷所致的细胞凋亡（P＜0.05），详见图2。

  

图1 各组的pAMPK表达水平

  

图2 各组的Caspaxe-3 cragment表达水平

3 讨论

随着现代医学的发展，有相当一部分患儿不得不在全身麻醉下接受手术治疗。有统计资料表明，仅美国每年就约有600万儿童患者接受手术和麻醉，其中包括150万婴幼儿。麻醉对婴儿神经系统发育影响，是目前临床麻醉最热门的话题之一。既往动物实验表明，麻醉药对新生动物有一定的神经毒性作用。因此，阐明麻醉药物神经毒性的机制，寻找预防和治疗麻醉药物致认知功能障碍的新靶点成了亟需解决的问题。AMPK是重要的细胞能量感受器，当细胞受到损伤，线粒体功能障碍时，能够被迅速激活，代偿性上调的pAMPK能通过激活相关分子通路，维护线粒体形态与功能的完整性，以缓解应激状态下细胞受到的伤害［6］。已有文献报道，吸入麻醉药会引起细胞内氧自由基急剧上升，损伤线粒体，最终引起细胞凋亡［7］。本研究结果显示，七氟烷同样会引起AMPK的激活，反映出七氟烷很可能通过线粒体途径最终引起H4细胞的凋亡。本研究中，二甲双胍作为AMPK激动剂，进一步上调该保护性因子的表达，从而起到保护H4细胞的作用；本研究结果提示，二甲双胍除了作为降糖药用于治疗Ⅱ型糖尿病外，还可能对吸入麻醉药的神经毒性起到保护作用。事实上，已有不少研究显示，二甲双胍对阿尔茨海默病、帕金森氏病等神经退行性疾病具有积极的作用［8，9］。本研究结果说明，在七氟烷致H4细胞凋亡的模型中，通过AMPK激动剂进一步增加七氟烷所致的pAMPK上调，能够减少细胞凋亡。我们推测AMPK在该模型中充当保护性因子；二甲双胍作为AMPK激动剂，对神经系统具有潜在的保护作用。因此，进一步的研究将为缓解吸入麻醉药相关神经毒性提供新的靶点。

参考文献

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