高血糖在高草酸尿环境下促进肾草酸钙结石形成的机制研究

泌尿系结石是泌尿外科常见的疾病，我国南方地区尤为多发，其发病率达5%～10%，一半以上的结石患者在5～10年内可再次形成结石，20年内则该比例上升至75%［1］。高发病率及复发率，尚不明确的发病机制以及主要影响工作年龄成人的特点导致泌尿系结石成为严重的卫生问题［2，3］。

近年来大宗临床研究分析发现，在代谢综合征患者中，血糖浓度的变化与泌尿系结石的发病率密切相关，高血糖能显著增加结石发病率，是泌尿系结石形成的独立危险因素［4，5］。高血糖能导致一系列细胞功能改变，促使大量细胞因子如p⁃IRE1α、BiP，IL⁃6，IL⁃8，IP⁃10和MCP⁃1、促凝物介质组织因子（TF）的释放［6］，诱导细胞的凋亡［7］，导致失明（视网膜病），末期肾衰竭（肾病），周围神经病和糖尿病心肌病的发生。而肾结石形成过程中存在相同的病理过程，肾小管上皮细胞凋亡能为结石提供黏附位点，大量细胞因子则在钙盐沉积、结晶黏附、炎症趋化、氧化损伤中发挥着促进或抑制作用。目前，高血糖促进肾结石形成的机制尚未得到阐明，因此本研究拟探讨高血糖促进草酸钙结石形成的机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株及主要试剂

HK⁃2细胞购于ATCC公司；DMEM/F12细胞培养基购于GIBCO公司；β⁃D⁃Glucose购于南京生兴生物公司。人MCP⁃1、OPN ELISA试剂盒购于武汉博士德公司；Tunel试剂盒购于Roche公司；钙盐染色试剂盒购于福州迈新生物公司；鼠MCP⁃1 ELISA试剂盒购于武汉Elabscience公司；OPN抗体购于美国BioScience公司；Trizol、Prime ScriptTMRT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM荧光PCR试剂盒购于日本Takara公司；

1.2 实时荧光定量PCR

使用TrizolRNA plus提取细胞总RNA，然后用mRNA逆转录试剂盒进行逆转录反应合成cDNA，PCR扩增反应及检测采用SYBR CreenⅡ方法。引物序列分别为：OPN：F：5′⁃GGACATCACCTCACA⁃CATGGA⁃3′；R：5′⁃GTGGGTTTCAGCACTCTGGTC⁃3′；MCP⁃1：F：5′⁃TTCTGTGCCTGCTGCTCATAG⁃3′；R：5′⁃GCTTCTTTGGGACACTTGCTG⁃3′；Cbfa1：F：5′⁃CCCCAAGACACAGTTCCCTA⁃3′；R：5′⁃GAGACCG⁃CAGTCCGTCTAAG⁃3′；BMP2：F：5′⁃CCCCAAGA⁃CACAGTTCCCTA ⁃3′；R：5′⁃GAGACCGCAGTCC⁃GTCTAAG⁃3′。

1.3 酶联免疫吸附试验

使用ELISA试剂盒，将样本与抗体孵育后加入酶标二抗，通过TMB液进行显色，待显色满意后加入终止液，终止显色。选择450 nm波长，使用荧光双波长分光光度计测定样品吸光值。通过标准样品建立标准曲线，计算待测样品值。

1.4 动物模型建立及取材

用SPSS13.0版软件完成所有统计分析，采用两独立样本的t检验处理符合正态分布的计量资料。检验水准P=0.05。

组织细胞凋亡试验（Tunel试验）：常规脱蜡，先后滴加蛋白酶K及Tunel反应混合液，37℃的暗湿盒中反应30 min后DAB显色，苏木素复染。免疫组化染色则常规脱蜡后用微波炉高温修复，修复液为柠檬酸缓冲液（CB，pH6.0），加入OPN多克隆抗体，4℃冰箱过夜孵育后，加入二抗，37℃恒温箱内孵育30 min，以DAB显色，细胞核用苏木素衬染，常规脱水透明，中性树胶封固。

1.5 钙盐染色、组织细胞凋亡试验及免疫组化染色

PCR结果显示，在高糖环境下，肾小管上皮细胞OPN、MCP⁃1表达显著增加，与对照组相比有统计学差异（*P＜0.05）（图1）。

在智能合约中封装了预先设定的响应条件、触发条件等内容。各个节点就所签署的合约达成一致后将合约内容以代码的形式嵌入区块链中。一旦有满足合约中相应条件或者触发条件时，自动激活并且执行智能合约。

1.6 统计学方法

选取八周龄Wistar雄性大鼠（共40只）随机分为4组，分别是阴性对照组，高草酸尿模型组，高血糖模型组，高血糖合并高草酸尿模型组；每组10只。高血糖动物模型构建按四氧嘧啶尾静脉注射法。每7天收集静脉血一次，测定随机血糖值，血糖浓度低于16.7 mmol/L从实验中剔除。高草酸尿动物模型构建按乙二醇法。本实验以无菌饮用水稀释乙二醇，最终浓度为0.5%，以150 mL/day进行喂养。建模成功后将各组大鼠饲养于代谢笼中24 h，收集24 h尿液标本，之后将大鼠处死并取肾，10%多聚甲醛中固定。

ELISA试验结果显示，建立模型14天后，在高血糖合并高草酸尿模型组大鼠24小时尿液中，MCP⁃1表达明显增加，高血糖组及高草酸尿组有一定表达，对照组MCP⁃1表达最少。（*示高血糖模型组与其余三组相比表达有统计学差异，P＜0.05；**示高草酸尿模型组与其余三组相比表达有统计学差异，P＜0.05；***示高血糖合并高草酸尿模型组与其余三组相比表达有统计学差异，P＜0.05）（图6）。

2 结果

2.1 高糖环境显著促进HK⁃2细胞中肾结石相关蛋白OPN、MCP⁃1的表达

  

图1 不同葡萄糖浓度下细胞OPN、MCP⁃1、Cbfa1、BMP⁃2相对表达量

钙盐染色（Von Kossa法）：脱蜡后滴加适量2%硝酸银后将玻片置于强光下60 min，再用5%硫代硫酸钠水溶液处理2 min，0.1%核固红染液染核。

在进行企业各机构的预算管理工作时，应该严格按照市场经济的发展趋势进行企业体制改革，尤其是在预算管理方面。具体而言，可以在管理中推行《企业财务预算管理制度》，在制度的执行过程中，无论是财务管理者还是预算执行者，均需要对已经统一编制完成的预算管理原则以及相应的编制依据了若指掌，唯有如此，才能更好的将企业的预算管理情况与实际收支状况相整合出来，最终交由企业预算管理部门进行综合处理。另一方面，为了保障企业预算管理中不会出现赤字情况，还需要就日常的预算进行实时统计分析，借以提升资金运行效率，确保企业收支平衡。

  

图2 不同浓度葡萄糖培养基中OPN、MCP⁃1浓度

ELISA检测培养基中OPN、MCP⁃1的浓度，结果显示，在高糖环境下，OPN、MCP⁃1浓度显著升高，与对照组相比有统计学差异（*P＜0.05）（图2）。

2.2 高血糖显著促进大鼠肾小管内钙盐沉积

目前研究认为，草酸钙结石形成需要经历以下三个过程：结晶的形成，黏附，聚集。其中，黏附对结石形成尤为重要［8］。正常人尿液内草酸钙处于过饱和状态，而正常人之所以不形成肾结石，是由于尿液中的晶体可以随着尿液的冲刷作用排出，难以聚集生长［9］。而肾小管上皮细胞受损，破坏了上皮细胞的完整性，是增加结晶黏附的重要原因［10］。

  

图3 钙盐染色a、b、c、d分为对照组，高血糖组，高草酸尿组，高血糖合并高草酸尿组；（400倍）

2.3 高血糖显著促进大鼠肾小管细胞凋亡

组织凋亡试验显示，建立模型14天后，在高血糖合并高草酸尿模型组大鼠肾组织中，可见大量肾小管上皮细胞凋亡，其余三组仅少量细胞凋亡（图4）。

  

图4 组织凋亡试验a、b、c、d分为对照组，高血糖组，高草酸尿组，高血糖合并高草酸尿组；（400倍）

2.4 高血糖显著促进大鼠肾小管细胞OPN表达上调

OPN免疫组化结果显示，建立模型14天后，在高血糖合并高草酸尿模型组大鼠肾组织中，可见OPN表达明显增加，高血糖组及高草酸尿组有一定表达，对照组无明显OPN表达（图5）。

2.5 高血糖显著促进大鼠尿液中MCP⁃1的表达

  

图5 OPN免疫组化结果a、b、c、d分为对照组，高血糖组，高草酸尿组，高血糖合并高草酸尿组；（400倍）

  

图6 大鼠24小时尿液中MCP⁃1表达量

随着运营时间的增加，杂散电流逐渐增加，当杂散电流累计到一定程度，且没有一个良好的电气通路及时回到变电所负极时，就会造成杂散电流四散流至轨道交通主体结构、附属结构以及公共设施管道，从而对其造成一定程度的腐蚀。

3 讨论

钙盐染色显示，建立模型14天后，在高血糖合并高草酸尿模型组大鼠肾组织中，可见大量草酸钙结石晶体，其余三组均未观察到有结石晶体（图3）。

我们的实验发现，高血糖合并高草酸尿模型组大鼠肾组织中存在大量凋亡细胞及大量草酸钙结石晶体形成，而其余三组则未见明显细胞凋亡及结石形成。上述结果提示，在高草酸尿环境下，高血糖能促进肾小管上皮细胞凋亡，草酸钙结石形成。肾小管上皮细胞损伤后能为草酸钙晶体黏附提供位点，可能是高血糖促进草酸钙结石形成的重要原因。

高血糖促进肾小管上皮细胞的凋亡的机制尚不清楚，尽管可能与其降解产物有关［11］。在对成石相关基因的筛查中我们发现，肾小管上皮细胞的OPN和MCP⁃1表达明显升高，动物模型组织中的表达中存在同样的趋势。OPN即骨桥蛋白，又被称为分泌磷蛋白（SPP1）和早期T淋巴细胞激活因子（ETA⁃1），参与包括骨重塑，先天性免疫，急性和慢性炎症及肿瘤等生理及病理过程。研究表明，OPN能募集巨噬细胞，增强Th1介导的免疫反应［12］。还能诱导中性粒细胞迁移［13］，促进NK细胞迁移及活化［14］。OPN还参与T细胞的极化过程［15］，是重要的炎症趋化因子。MCP⁃1即单核细胞趋化蛋白-1，属于CC亚家族成员，可结合单核细胞表达的趋化因子受体CCR2，使单核细胞分化为巨噬细胞并从血流迁移到炎症部位［16］。OPN、MCP⁃1作为重要的炎症趋化因子，能加重局部炎症反应，损伤组织细胞。因此我们推测，高血糖促进肾小管细胞凋亡的机制可能与OPN、MCP⁃1表达增加诱导的炎症反应相关。

综上所述，本研究证实，高血糖能促使肾小管上皮细胞炎症趋化因子OPN、MCP⁃1表达增加。在高草酸尿环境中，高血糖能促进肾小管上皮细胞凋亡及草酸钙结石形成。高血糖可能是通过炎症趋化因子加重局部炎症反应，促进肾小管上皮细胞凋亡及草酸钙结石形成。深入研究有望为草酸钙结石预防及治疗提供新的思路。

(二)独立的双喙鸟纹。反山12号墓出土的玉琮上有独立的双喙鸟纹，它的造型为两个圆圈，无卷云纹填充，左右各和一尖端物，类似鸟喙，见图5。

修整部分主要针对文件破损、字迹模糊或褪色、装订材料易锈蚀氧化及文件幅面过大等问题，这些问题不利于档案的长期保存，也会影响档案的真实性。增加修整内容既是基于档案工作的实际，也是基于保护档案的需要。

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