以ADSCs附着ADM植入促进扩张皮瓣真皮修复的实验研究

前 言

皮肤软组织扩张技术可以为患者提供外表及颜色相近的扩张皮瓣以覆盖缺损创面，然而，扩张皮瓣的形成耗时较长，容易引起各种并发症，平均并发症发生率在17.44%［1］。随着对扩张器机制的认识的深入及相关技术的发展，减少该技术并发症的发生、加快扩张速度成为了可能。Razzak MA等［2］认为扩张器对皮肤的作用的核心在于机械力促进细胞分泌、增殖及拉伸部位血供的增加。由于机械力拉伸皮肤短时间增大的面积难以长存，在撤去机械力后皮肤会回缩，只有在拉伸过程中因皮肤增殖作用所产生的皮肤面积才是临床上可用于手术的扩张皮瓣。研究发现，拉力拥有促进细胞增殖、分化、抑制其凋亡等方面的作用［3，4］，然而在机械力促细胞增殖的同时，机械力拉伸的直接效应是对皮肤的损伤。真皮层的成分是胶原纤维，主要是由Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维以4∶1的比例构成真皮层致密的网状结构［5］。机械力的拉伸诱导的细胞增殖、血管增生等修复作用难以快速修复真皮层所受的损伤。因此有一定几率发生扩张皮瓣破裂等软组织扩张并发症。真皮层修复方面的机制相当复杂，其发生机制尚未明确，针对这点的研究方向较多，干细胞疗法即为其中的一个方向。

就像我开头提到的那位95后小伙子，他的愿望相当好，一如我当年，一心想在外面混好了，把父母兄弟都接过来。可越是迫切的愿望，越容易走向反面。我也觉得，事物本身发展的基本规律是，执拗地违背人的主观意志。2016年，疾病让我两次住院。多次走在街上，忽然感到自己马上就不行了，晕眩、心悸、意识模糊、强烈的濒死感，一波一波涌来，而强烈的求生本能让我在惊慌失措之余，第一个想到的是，赶紧到医院去。对于病人来说，医院比家更可靠，更值得信赖。

脂肪干细胞（adipose⁃derived stem cells，AD⁃SCs）是干细胞家族的重要成员之一，有着促进组织修复、再生的功能，具备着提升真皮层修复速度的潜力。有研究证实ADSCs促进伤口周围组织的血管化、胶原合成［6］和降低胶原酶的合成［7］。曾有学者将ADSCs依附于脱细胞真皮基质（Acellular dermis matrix，ADM）上，并将其置于皮下，证实自体ADM加上ADSCs可以有效提升作用处皮肤的血管密度及真皮层胶原含量［8］。研究提出附着于支架上的干细胞可以分泌血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子⁃β（TGF⁃β）、血小板衍生生长因子（PDGF）、胰岛素样生长因子（IGF）和肝细胞生长因子（HGF），从而促进伤口的愈合［9，10］。然而，干细胞在生物体内的生存率较低。普遍状况下需要干细胞治疗的部位都存在缺氧、炎症因子等易导致干细胞凋亡的因素［11］，多数研究都认为干细胞在生物体内存活时间一般在1周左右，难以长期保持活性并发挥其分泌作用。因此，学者们使用了各种手段提高干细胞在生物体内的生存率，包括P物质［12］、普兰尼克F127水凝胶［13］等，研究证实使用生物相容性高的支架可以提高干细胞的生存率和移植效果［13，14］。

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本实验组先前实验中证实同种异体脱细胞真皮基质植入后与宿主组织融合良好，可降低扩张皮瓣的回缩率，在一定程度上优化了扩张皮瓣的物理学性质，提高扩张皮瓣的性质。在此基础上，结合真皮层下层成纤维细胞的功能研究，下层成纤维细胞主要起着修复真皮组织的功能［15］，我们由此得出实验的假想，以ADM为载体，将ADSCs送入真皮层下方，进一步促进成纤维细胞分泌合成细胞外基质，进而提升扩张皮瓣扩张期间真皮层的自我恢复效率，降低扩张器并发症发生率，提高扩张速度。因此，本研究拟以真皮内成纤维细胞分泌功能为评价指标、从TGF⁃β1初步评价ADSCs对承受机械力的皮肤的影响，为脂肪干细胞改善组织扩张技术提供相应实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

如图2所示，使用干细胞表面标记物CD34及CD90抗体对ADSCs进行检测，结果提示所得细胞CD34阴性，CD90阳性，符合脂肪干细胞表面标记物的特征。

真皮层组织学变化；真皮层成纤维细胞的胶原合成水平；TGF⁃β1相对表达量

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本研究采用由Chen RN等［16］人于2004年提出的方法，使用将胰蛋白酶、中性蛋白酶及低渗盐溶液相结合的方案进行脱细胞真皮基质制备。整个制作过程保持无菌操作。具体步骤如下：取大鼠背部皮肤，除去被毛及皮下组织，后将皮肤置于0.25%胰酶溶液中，浸泡、震荡18小时，室温；更换0.25%胰酶溶液，继续浸泡、震荡12小时，室温；置于0.1%十二烷基磺酸钠溶液（SDS），浸泡、震荡12小时，室温；置于560 U/L中性蛋白酶溶液（DispaseⅡ），浸泡、震荡12小时，室温；置于0.1%SDS中，浸泡、震荡12小时，室温；PBS漂洗2次，每15 min，室温。上述全部溶液中均加入10 μg/mL庆大霉素。将制备好的ADM于PBS中浸泡、震荡24小时，室温，清除ADM内的细胞碎片等杂质；将ADM于脂肪干细胞培养基中浸泡、震荡24小时，室温，更换培养基，继续浸泡、震荡24小时，室温。

1.2 ADSCs培养及传代

将ADSCs从液氮罐中取出，放置于37℃温水浴，待融化后将其取出。加入已装有10 mL培养基的15 mL离心管中，混匀后以20℃、1500 r/min离心5分钟，将上清液弃去，加入3 mL培养基重悬，后即可将其接种到培养瓶中，加入适当培养基后置于37℃、5%CO2培养箱中。一般而言2天更换一次培养基，当细胞达80%～90%融合时即可以1∶3的比例传代。本实验采用的细胞为P4和P5的ADSCs。

1.3 ADSCs免疫荧光鉴定

如图3所示，将ADSCs附着于ADM上，冰冻切片下可见真皮层网状结构中存在着红色荧光，红色荧光代表了使用CM⁃Dil染色的脂肪干细胞。

1.4 动物模型制备

本课题将6周龄雌性SD大鼠作为实验动物，平均体重为299.13±13.12 g（n=30）。麻醉方式：以3%戊巴比妥钠注射液按照40 mg/kg的剂量进行腹腔注射麻醉。麻醉满意后，备皮。确定肩胛骨下角位置，在两侧肩胛骨下角连线下方约0.5 cm处开始，沿背部中线设计长约2.0 cm的纵行切口（图1A）。术野常规消毒、铺巾。切开皮肤，钝性分离皮肤与皮下组织。首先，通过背部切口向头端开始分离，在头颈部皮肤下方分离一个约3 cm×3 cm的腔隙，用于放置扩张囊（扩张器规格：20 mL），于靠近尾端的背部皮下分离一个约1 cm×1 cm腔隙，用于放置注射壶。将预先制备好的ADM展平，置于皮肤与扩张囊之间，并使用可吸收缝线进行适当固定。原位缝合皮肤，术毕。术中向扩张囊中注水5 mL。术后第2天开始注水扩张，每隔1天通过注射壶向扩张囊中注射生理盐水2 mL，总扩张周期为21天。扩张期间注意观察切口及扩张区域有无感染、积液、坏死、皮肤破裂等术后并发症出现，必要时进行干预治疗，病情无法控制者及时予以安乐死处理。动物模型结果如图1所示。

  

图1 SD大鼠扩张器模型构建 A.大鼠软组织扩张术前标记；B.大鼠扩张器放置位置；C.术后3周；D.术后3周

1.5 ADM制备

基于已建立的ELV充电站选址评价模型，对评价指标进行确定和量化分析。具体求解流程基于地市级进行配网投入产出综合评价，并进行效益对比分析：

1.6 用CM⁃Dil对ADSCs进行染色后种到ADM上并检测

避光状态下，在贴壁的ADSCs培养皿中加入染色工作液，于37℃中孵育4 min，再于4℃中孵育15 min，加入PBS浸泡、振荡，弃去液体，用新鲜培养基重悬ADSCs。将制备的ADM裁剪成约1 cm×1 cm大小，放入六孔板中，每孔中加入一块1 cm×1 cm大小ADM；将密度为1×106、已用CM⁃Dil红色荧光标记的ADSCs悬液加入六孔板，每孔2 mL细胞悬液。将六孔板放入细胞培养箱中（37℃、5%CO2）48小时。

将种植了ADSCs的ADM以OCT包埋，制成冰冻切片，后于荧光显微镜下观察。

1.7 实验分组

将制备好的脱细胞真皮放置于6孔板内，并将制备好的ADSCs悬液接种到6孔板上，放入培养基培养24 h后将脱细胞真皮转移到新的6孔板内，重复操作5天，后将附着脂肪干细胞的脱细胞真皮取出，经手术放入SD大鼠扩张皮肤下方。①对照A组：SD大鼠扩张皮肤下方放置着未种植细胞的ADM；②ADSCs实验组：SD大鼠扩张皮肤下方放置着附着ADSCs的ADM。各组分别于1周、2周、3周时取材。

1.8 western对胶原合成检测

向每50 mg的组织中加入500 mL的RIPA和5 μL的PMSF，电动匀浆提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定各组ColⅠ、ColⅢ和fibronectin蛋白浓度。按蛋白量40 μg/每孔进行10%SDSPAGE凝胶电泳（先80V恒压后120V恒压），电，转膜（400 mA 2 h）至PVDF膜，于5%BSA粉封闭液内，摇床震动室温封闭2 h，加入1∶1000稀释的一抗，摇床4℃过夜，TBST缓冲液洗膜（10 min×3次），加1∶10000稀释的二抗，摇床室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜（10 min×3次），应用ECL化学发光，显影。用软件对Western条带进行定量分析。

1.9 QPCR检测TGF⁃β1表达

用RNA裂解液于匀浆器中对组织进行裂解，提取RNA，用无水乙醇及离心柱提纯RNA，后应用反转录试剂盒，严格按照说明书将提取的RNA逆转录为cDNA。设计引物序列（见表1）。在ABI Step One QPCR仪上进行PCR体系的扩增及反应。反应体系及反应条件（见表2）。

 

表1 QPCR检测TGF⁃β1的设计引物序列

  

Primer名称β⁃ACTIN扩增长度（bp）183 TGFB1序列（5′-3′）Forward primer：GATCAAGATCATTGCTCCTCCTG Reverse primer：AGGGTGTAAAACGCAGCTCA Forward primer：GACTCTCCACCTGCAAGACC Reverse primer：GGACTGGCGAGCCTTAGTTT 100

1.10 主要观察指标

主要实验试剂与材料：20 mL一次性使用扩张器购自广州市万和整形材料有限公司，大鼠脂肪干细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，大鼠脂肪干细胞完全培养基、抗CD34抗体、抗CD90抗体购自Abcam公司，抗TGF⁃β1抗体购自immuno⁃way公司，抗ColⅠ抗体Proteintech公司，抗ColⅢ抗体immunoway公司，活细胞染色剂CM⁃Dil购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.11 统计分析

使用SPSS对数据结果进行统计分析，数据以均数±标准差表示，各组间数据比较采用t检验和单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学上显著性意义。

 

表2 QPCR检测TGF⁃β1的反应体系及反应条件

  

Real time PCR反应体系CDNA模板SYBRGreen/ROXqPCR Master Mix（2×）引物-1（10 μM）引物-2（10 μM）ddH2O总体积1 μL 5 μL Real time PCR反应条件UDG预处理50℃ 2 min预变性95℃ 10 min 0.3 μL 0.3 μL补水至10 μL 10 μL变性95℃ 15 s退火60℃ 1 min 40循环↓↓↓Melt■■■■■ ■■

2 结果

2.1 ADSCs鉴定结果

SPF级6周龄雌性SD大鼠，由广东省动物实验中心提供。

2.2 ADSCs附着ADM鉴定

使用CD34、CD90抗体对培养的ADSCs行免疫荧光染色。

  

图2 ADSCs免疫荧光鉴定 A.CD34免疫荧光；B.CD90免疫荧光

2.3 脂肪干细胞对受扩张器作用皮肤组织学上的影响

放置扩张器3周后，将放置ADM处的皮肤切除取出，制成石蜡切片并以Massion染色，结果示（图4）：A图中ADM与皮肤组织皮下肌肉层有部分粘连，其中可见较多浸润细胞（红色），B图可见皮肤真皮层内腺体增殖明显，血管丰富。如图5所示，对实验组皮肤组织进行TGF⁃β1免疫组化染色后，可见实验组的大鼠皮肤中TGF⁃β1表达主要分布于皮肤组织的血管及腺体周围（黑色箭头），而对照组阳性表达极少，实验组与对照组相比TGF⁃β1的表达明显增多。

考虑风电不确定性的电气能源系统两阶段分布鲁棒协同调度//税月,刘俊勇,高红均,邱高,胥威汀,苟竞//(13):43

  

图3 ADSCs 附着于ADM的荧光染色，红色荧光的为ADSCs

  

图4 术后3周扩张皮瓣组织切片Massion染色 A.ADM与皮肤组织皮下肌肉层有部分粘连，其中可见较多浸润细胞（红色）（×40）；B.皮肤真皮层内腺体增殖明显，血管丰富（×100）

  

图5 术后1周扩张皮瓣TGF⁃β1免疫组化染色 A.实验组可见TGF⁃β1表达主要分布于皮肤组织的血管及腺体周围（黑色箭头，左侧扩张皮瓣，右侧ADM）（×100）；B.对照组与实验组相比阳性信号极少（右侧扩张皮瓣，左侧ADM）（×100）

2.4 脂肪干细胞对受扩张器作用皮肤内成纤维细胞分泌作用的影响

TGF⁃β1的QPCR结果：对各组皮肤组织内TGF⁃β1的mRNA表达水平的检测结果提示，在同等时间内，实验组与对照组的TGF⁃β1表达量相比较，实验组的表达量均高于对照组（P＜0.05）（图9）。在术后第一周，实验组及对照组TGF⁃β1的表达量显著上调，形成分泌高峰，之后第二、三周表达量呈下降趋势，逐渐减少，实验组的各个时间段表达量之间两两相互比较均具备统计学意义（P＜0.05），对照组的结果与实验组相同（图10）。

  

图6 Western blot检测扩张皮瓣Fibronectin蛋白含量

  

图7 Western blot检测扩张皮瓣ColⅠ蛋白含量

  

图8 Western blot检测扩张皮瓣ColⅢ蛋白含量

2.5 脂肪干细胞对受扩张器作用皮肤内TGF⁃β1合成的影响

通过蛋白质印迹法对皮肤组织内分泌的胶原纤维Ⅰ、Ⅲ及纤连蛋白进行检测，将各周的实验组及对照组进行比较。结果如图6～8所示。对各个条带的灰度值进行统计分析，结果提示：ColⅠ及纤连蛋白的分泌量在第一周和第二周时实验明显超过对照组（P＜0.05），而在第三周时实验组与对照组相比其差异并未有统计学意义。并且可以看出，这两种物质在第一、二周的分泌较多，到第三周有一个明显衰减。ColⅢ的分泌趋势则不明显，仅在第二周时其实验组及对照组的比较具备统计学上的意义（P＜0.05）。

该研究中一般资料以及结果资料等数据均经SPSS20.0分析。计量资料采用t检验,计数资料以x2检验,有统计学意义以P<0.05表示。

  

图9 QPCR检测扩张皮瓣TGF⁃β1含量（实验组与对照组相比）

  

图10 QPCR检测扩张皮瓣TGF⁃β1含量（组内每个时间组别之间相比）

3 讨论

对机械力拉伸皮肤的研究发现，在受到机械牵张时皮肤发生的即刻改变主要是弹性拉伸和流体位移，细胞的蠕动爬行发生在此后的数分钟至数小时内，而最终皮肤面积的增大的原因在于细胞的增殖、皮肤新生血管的增多及细胞外基质稳态的改变［2］。弹性拉伸和细胞的蠕动爬行造成的面积增长在撤去张力后会很快回缩，新生皮肤才能作为修复创面的有效面积。细胞层面上，扩张皮肤表皮层鳞状上皮细胞增殖活跃、厚度增加，细胞增殖以缓解力的拉伸；真皮层胶原合成增强但增强的强度不足以应对机械力的持续拉伸，真皮层胶原纤维被拉长、变细甚至部分断裂；真皮下脂肪细胞数目明显减少并最终导致皮下脂肪层永久性萎缩、消失［17］。更有研究指出，机械力作用于皮肤可以引起蛋白酶表达增加，从而调节细胞外基质［18］。真皮层的厚度占据皮肤总厚度的绝大多数，因此真皮层的变薄致使总体皮肤菲薄，机械强度下降，易破裂。

很多学者都认同干细胞在修复、再生方面的作用，然而如何较好地发挥干细胞的这种作用仍是一个难题。部分学者的研究方向是先静脉注射间充质干细胞，后研究如何提高干细胞的归巢效应，然而难以保证有足够量的细胞归巢至某个部位。最新研究显示，将已标记的干细胞悬液注射到皮下，经荧光追踪发现约20天后干细胞完全消失，难以在人体皮下长期存活［19，20］。因此现代的观点认为干细胞的治疗作用更多在于干细胞分泌的各种物质的作用，甚至干细胞本身死亡后释放出的物质，干细胞本身的分化修复在其中发挥的作用较少。本实验中干细胞的分泌作用主要集中于第一、二周，到第三周此时干细胞的作用较为微弱，提示采取干细胞附着脱细胞真皮基质的方法的存活时间与注射皮下。具体存活时间及相关存活率可待进一步研究。

“绿色教育”［1］是指无伤害、无污染，消除副作用的教育，是教育工作者在对教育对象施加影响的过程中，强化绿色意识，防止不合理的教育手段、不适宜的教育形式或不恰当的教育方式对施教对象构成伤害的一种教育模式。学校是精神文明建设的主阵地和辐射源，担负着教书育人的神圣使命，新形势下开展心理健康教育工作，要以人为本，构筑绿色教育新模式。

ADSCs的旁分泌物质直接作用于承受机械力的成纤维细胞，结果提示受作用的皮肤内Ⅰ型胶原及纤连蛋白含量对比无ADSCs组升高较多，具有统计学意义，提示ADSCs的旁分泌作用可以有效促进成纤维细胞的分泌作用，使得成纤维细胞在原本机械力促进的基础上进一步加强。

TGF⁃β1在促进胶原合成方面起着重要作用。TGF⁃β1可以直接促进胶原合成的增加，也可以间接合成金属蛋白酶从而提高细胞外基质的生成［21］。实验研究发现TGF⁃β1能够激活成纤维细胞上的PI3K/Akt信号通路从而提高细胞外基质成分的合成［22，23］。本实验检测了 ADSCs对成纤维细胞作用后皮肤内TGF⁃β1含量的变化，结果提示ADSCs的旁分泌作用显著提高皮肤内TGF⁃β1的含量。然而需要注意的是，TGF⁃β1在细胞基质中大部分以无活性的复合体形式存在，ADSCs的作用是通过分泌蛋白激活无活性TGF⁃β1实现的还是通过自身分泌少量TGF引起的级联反应，仍有待进一步深入研究。

综上所述，将ADSCs加入扩张器模型中，ADSCs诱导皮肤组织中的TGF⁃β1增加，进而促进真皮层下层成纤维细胞分泌更多的胶原结构与蛋白，促进了真皮层的修复，为临床上运用干细胞治疗减少软组织扩张技术并发症的发生率提供了参考。

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