LINC00475在肾癌中的临床意义及其对肾癌细胞786⁃O的影响

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）或称肾癌是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，占肾脏恶性肿瘤的80%～90%及成人恶性肿瘤的2%～3%，且其发病率及死亡率仍逐年上升。肾癌对化疗、放疗不敏感，治疗肾癌的主要方法仍然是手术切除［1］。但是，对于转移性肾癌，极少数患者可通过外科手术途径获得较长生存期［2］。因此，探索肾癌发生、发展的分子机制，研究肾癌的分子标记物，寻找高效的分子治疗靶点对于提高肾癌患者生存率具有重要作用。

9、P-GW更新承载上下文，并向new S-GW返回Modify Bearer Response消息。

在人类基因组中，人们将碱基对大于200的不参与编码蛋白的RNA称为长链非编码RNA（Long Noncoding RNAs，lncRNAs）［3］。根据 lncRNAs在基因组中的位置，可将其分为正义lncRNAs、反义lncRNAs、双向性lncRNAs、基因内lncRNAs和基因间lncRNAs（lincRNAs）五种。lncRNAs在多种肿瘤细胞中存在异常表达并扮演重要角色［4］。在肿瘤中，lncRNAs可通过作为支架连接相关RNA、DNA或蛋白质、作为竞争内源性RNA竞争miRNA的结合位点等作用调控靶基因的表达，行使着癌基因或者抑癌基因的作用［4，5］。

从图7可以看出，此问题中可连接（0,0）点与（1,1）点的线段，作线段的平行线并且与二次函数相切，所以函数差距离的最大值的最小值应该是这两条平行线的垂直距离的一半。

lncRNAs在肾癌中的研究仍十分有限。我们发现长链非编码RNA LINC00475在肾癌组织中高表达，且与肾癌患者的预后呈负相关关系，但目前并无关于LINC00475的任何报道。本研究旨在分析LINC00475在肾癌中的表达情况及与患者临床指标的相关性，并在体外研究LINC00475对肾癌细胞增殖、转移能力的影响，利用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）探讨LINC00475在肾癌中可能参与的分子机制，希望能为肾癌早期诊断和预后提供新指标，为肾癌治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

为了避免脱靶效应，我们分别转染两条siRNA（si#1、si#2）进入786⁃O中，发现与对照组（NC组）相比，LINC00475的表达量明显下降。表明siRNA可以有效下调LINC00475的表达（P＜0.05，图3）。

1.1.3 细胞株人肾癌细胞株786⁃O购自美国模式培养物集存库。

根据农业部数据，自1940年代开始，美式起司的制造数量领先其他种类起司一甲子。1940-1950年代，美国还有瑞士起司、意式起司和其他起司，每年约生产数千万到1亿多磅。意式起司19世纪70年代成为美国第二热门起司，19世纪80年代从约 1亿磅产量快速增加，到了2000年代已突破3亿磅。意式起司在2005年首度超越美式起司产量，两种起司交缠竞争几年后，意式起司自2010年起稳定超越美式起司。

三十年来，于国强以路为业，以站为家，一步一个脚印，用一双手、一只扫帚、一把铁锹，从一个学徒工到高级技师，从普通职工到模范标兵。他就像铺路石一样，用不屈的脊梁筑起了平安坦途。

利用向量空间模型计算文本相关度是一种常用的计算相关性的方法，在本文中，实现了该算法。问题集特征项的权值计算公式为

采用SPSS 18.0.0软件进行统计分析。上述实验均重复3次，实验结果以表示。LINC00475的表达量与临床特征的关系采用t检验，生存分析采用Kaplan⁃Meier法及log⁃rank检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。GSEA通过JAVA程序运行［8］。GSEA芯片数据来自TCGA数据库，将LINC00475表达量最高的前20例作为高表达组，表达量最低的前20例作为低表达组，构建芯片表达谱数据集文件。功能基因集文件采用BioCarta gene sets（217个基因集）、KEGG gene sets（186个基因集）和oncogenic signatures（189个基因集），GSEA结果采用Cytoscape的图示表达。

1.2 方法

1.2.1 收集临床标本 手术结束后立即收取肾癌组织以及癌旁正常组织。所取癌旁正常组织均距癌组织边界2 cm以上。组织标本取得后立即存放于液氮中保存。

1.2.2 LINC00475表达水平检测 ①提取RNA：取出标本，剪取绿豆大小的组织，利用液氮研磨法研磨至粉末状，加入RNAiso Plus 2 mL后按照Trizol法提取RNA；②逆转录：按照逆转录试剂盒步骤对提取的RNA进行逆转录，逆转录程序为：37℃15 min，85℃5 s。③荧光定量PCR：将逆转录所得的cDNA模板稀释10倍，按照荧光定量PCR的反应体系：SYBR Green I Master 5 μL，cDNA模板 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 2 μL。反应程序为：95℃ 5 s，56℃ 15 s，72℃ 15 s，共 40 个循环。

1.2.3 细胞培养 将786⁃O、ACHN细胞培养于RPMI 1640培养基中，培养基含10%FBS、1%青霉素⁃链霉素混合液。放置于37℃、5%CO2培养箱中，并取对数生长期细胞进行实验。

1.2.4 细胞转染待细胞长至对数生长期时，取细胞接种于6孔板中过夜。细胞贴壁并长至50%～60%时，利用LipofectamineRNAiMAX并按照说明书步骤将LINC00475的siRNA（si#1、si#2）以及阴性对照序列（NC）转染进入细胞中，隔天换液。转染后48 h收取细胞进行细胞功能学实验或者提取RNA。

观察组患儿退热时间、鼻塞消退时间、咳嗽消退时间、咽充血消退时间均明显短于对照组,组间差异较为显著,P<0.05。见表2

1.2.5 MTS法检测细胞增殖 取转染siRNA后48 h的肾癌细胞接种于96孔板，设为对照组（NC组）以及沉默组（si#1、si#2组），每组设置3个复孔，每孔加入含1000个细胞的100 μL细胞悬浮液，分别于0 h、24 h、48 h、72 h、96h、120 h加入MTS试剂20 μL，4 h后利用酶标仪检测490 nm处各孔的吸光值（OD）。并以此绘制生长曲线。

1.1.2 临床肾癌组织 本文于2012～2017年收集共43对肾癌组织及癌旁正常组织，所取癌旁正常组织均距癌组织边界2 cm以上。标本均来自于中山大学孙逸仙纪念医院泌尿外科行肾癌根治性手术，且病理诊断确诊为肾透明细癌的肾癌患者。患者术前均无进行放疗、化疗。所用标本均得到所在医院伦理委员会批准，且获得患者知情同意并签署知情同意书。

1.2.7 Transwell法检测细胞迁移 取转染siRNA后48 h的肾癌细胞接种于Transwell小孔，设为对照组（NC组）以及沉默组（si#1、si#2组），每组设置3个复孔，每孔上室加入含5×104个细胞的200 μL无血清细胞悬浮液，下室加入600 μL含20%FBS的培养基。4 h后用4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%结晶紫溶液进行染色40 min，拍照后计算穿过半透膜的细胞个数。

1.2.6 克隆形成法检测细胞增殖 取转染siRNA后48 h的肾癌细胞接种于6孔板，设为对照组（NC组）以及沉默组（si#1、si#2组），每组设置3个复孔，每孔加入含1000个细胞的2 mL细胞悬浮液，14天后用4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%结晶紫溶液进行染色40 min，拍照后计算克隆形成的细胞群落个数

1.3 数据分析

1.1.4 试剂 LipofectamineRNAiMAX、RPMI 1640培养基购自美国Invitrogen公司；胎牛血清FBS购自美国Sigma公司；RNAiso Plus、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自Takara公司；引物合成于上海捷瑞生物工程有限公司，LINC00475上游引物：CGGAGACAGACCTGGACACT，下游引物：ATGTTCCAAAGTCGCAGCAC；β⁃actin上游引物为AGCCTCGCCTTTGCCGATCC，下游引物为ACAT⁃GCCGGAGCCGTTGTCG。LINC00475特异 siRNA si#1序列：GCGACTTTGGAACATGAAT，si#2序列：CCTAGAACAGTGTTAGAAA，设计并合成于广州市锐博生物科技有限公司。

2 结果

2.1 LINC00475在肾癌组织中高表达

LINC00475是位于人类染色体9q22.31，chr9：92141467⁃92159608，拥有4个外显子，转录本全长2000 bp。本研究通过比较TCGA数据库肾癌组织及癌旁正常组织中LINC00475的表达量，发现在LINC00475在肾癌组织中的表达明显高于正常组织（P＜0.05，图1A）。我们进一步在43对肾癌组织以及配对的癌旁正常组织中进行验证。结果表明，与上述结果一致，LINC00475在肾癌组织中高表达（P＜0.05，图1B）。

  

图1 LINC00475在肾癌中的表达情况 A.TCGA数据分析LINC00475在肾癌组织和正常组织中的表达情况；B.LINC00475在43例肾癌组织和癌旁正常组织中的表达情况

2.2 LINC00475的表达水平与肾癌患者预后的相关性

我们再进一步分析LINC00475的表达与患者临床特征的相关性，并将结果整理于表1。可见，男性患者中LINC00475的表达量高于女性患者（P=0.005），但与年龄无关。更重要的是，我们发现LINC00475表达水平与患者肿瘤stage分期（P=0.010）、M 分期（P=0.022）呈正相关。我们根据LINC00475的表达量将448例肾癌患者分为高表达组（n=224）和低表达组（n=224）。利用Kaplan⁃Meier法分析发现，高表达LINC00475的肾癌患者总体生存时间明显低于低表达LINC00475的肾癌患者（Log⁃rank P=0.012，图2）。

 

表1 LINC00475表达水平与肾癌患者临床指标的相关性

  

注：*P＜0.05具有统计学差异

 

例数LINC00475的表达量（LOG2）P值特征性别男 女288 160-2.778-2.2490.005*年龄（岁）＜60≥60病理分级G1-2 G3-4临床分期stageⅠ-ⅡstageⅢ-ⅣT分期T1-2 T3-4 M分期M0 M1 N分期N0 N1 205 243-2.449-2.4290.913 199 243-2.584-2.2550.071 260 186-2.627-2.1520.010*276 172-2.567-2.2320.074 376 72-2.529-1.9620.022*219 15-2.553-1.5400.050

  

图2 Kaplan⁃Meier分析LINC00475表达水平与肾癌患者预后的关系

2.3 siRNA可有效下调LINC00475的表达

1.1.1 TCGA数据库资料 下载TCGA数据库（https：//gdc？portal.nci.nih.gov/）［6，7］中肾透明细胞癌的数据。共有448例肾癌与67例癌旁正常组织的RNAseq数据以及对应的肾癌患者临床数据。

2.4 下调LINC00475抑制细胞的增殖能力及迁移能力

  

图3 siRNA有效下调LINC00475的表达水平

利用MTS法，我们发现下调LINC00475可以明显抑制786⁃O的增殖能力，其抑制程度具有统计学意义。我们进一步利用Transwell小室进行体外的迁移实验，培养4小时后，与NC组相比，下调LINC00475能够抑制786⁃O的迁移能力（P＜0.05，图4）。表明LINC00475在肾癌中具有促癌作用。

  

图4 LINC00475的表达对肾癌细胞786⁃O的影响 A.下调LINC00475抑制肾癌细胞786⁃O的增殖能力；B.下调LINC00475下调肾癌细胞786⁃O的迁移能力

2.5 GSEA分析LINC00475相关生物学通路

我们将TCGA数据库的肾癌RNAseq分为LINC00475高表达组（n=20）及低表达组（n=20），并对其进行GSEA分析，以此探讨肾癌中LINC00475参与的相关生物学通路。GSEA结果显示，在LINC00475高表达组中，与cyclin D1、VEGFA、WNT相关的基因集发生显著上调（NOM P＜0.01，FDR Q＜0.05，图5）。

  

图5 GSEA分析LINC00475相关生物学信号通路

3 讨论

lncRNAs的身份从之前的“噪声”到如今的基因调控因子的转变非常大，高通量技术的发展使越来越多的lncRNAs出现在科研人员的视野当中。尽管这些新发现的lncRNAs的作用大部分仍然是未知的，但研究发现，lncRNAs能在分子层面上调控基因表观遗传学上的表达，从而影响肿瘤的发生、生长、侵袭、转移等，还可以作为肿瘤标记物以及成为分子靶向治疗的靶点［9］。

由于肾癌的发生、发展在分子机制中涉及了多方面的综合因素，包括基因突变，基因组的不稳定性，表观遗传学改变等［1］。因此，肾癌相关lncRNAs也在肿瘤进展的过程中扮演重要角色。lncRNA GAS5（Growth Arrest⁃Specific Transcript 5）首次于1988年通过消减杂交技术从NIH3T3细胞中分离而得。GAS5作为一种抑癌基因，在肾癌细胞中的高表达可以诱导肾癌细胞的凋亡，抑制其增殖性、迁移性、侵袭性，遏止肿瘤细胞周期［10］。HOTAIR（HOX transcript antisense RNA）在肾癌中高表达［11］。HOTAIR可通过与甲基化酶复合体PRC2的相互作用，将PRC2复合物招募到HOXD基因簇，通过组蛋白甲基化下调靶基因的表达，从而调控AKT、WNT等信号通路，促进肿瘤的发生、发展［12］。

目前仍无LINC00475的相关研究。本研究通过下载分析TCGA数据库中肾癌的RNAseq数据，与癌旁正常组织相比，LINC00475在肾癌组织中显著高表达。并且在收集的手术切除的肾癌组织以及癌旁正常组织中得到了验证。我们利用统计学的方法，进一步分析TCGA数据库中的临床资料，发现LINC00475的表达与肾癌患者肿瘤分期、远处转移呈正比。而且高表达LINC00475的肾癌患者总体生存时间明显低于低表达LINC00475的肾癌患者。进一步在体外实验中，我们下调肾癌细胞786⁃O中LINC00475的表达量，发现肾癌细胞的增殖能力以及迁移能力明显下降。我们随后对TCGA肾癌数据进行GSEA分析，结果显示在肾癌中，LINC00475的表达可能通过激活WNT信号通路及cyclin D1、VEGFA等相关基因，增强细胞的增殖能力及迁移能力，进而促进肾癌的进展。

在走访过程中发现，虽然怀远石榴申请了地理标志证明商标，除了登记申请的怀远本地高品质的石榴，其余不能使用该商标。但是，许多外地经销商在石榴丰收的时节，利用卡车将外地石榴拉入怀远地区进行售卖。虽然不曾使用“怀远石榴”的商标，但是慕名而来的外地人在不知情的情况下选择了价格更低，品质不高的外地石榴。造成了外地石榴在怀远境内销售一空，而怀远当地石榴大量囤积的现象。这严重挫伤了农户的积极性，对怀远石榴的产业化发展造成了恶劣影响。

综上所述，我们的研究表明LINC00475的表达上调的肾癌患者预后更差，肾癌中高表达的LINC00475能够促进肾癌细胞的增殖、迁移能力，促进肾癌的进展。然而LINC00475在肾癌中参与的分子机制仍不明确，虽然GSEA分析提供了一定的研究方向，但仍需进一步的实验进行验证。

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