Polo样激酶3在前列腺癌中的表达及临床意义

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在世界范围内逐年增加［1］。前列腺癌经过手术治疗后仍可能发生复发，然而目前没有灵敏度和特异度高的肿瘤标志物。而前列腺癌的复发与细胞增殖密切相关。Polo样激酶（Polo⁃like kinases，Plks）家族是高度保守的丝-苏氨酸激酶，成员包括Plk1、Plk2、Plk3、Plk4和Plk5，在细胞周期中发挥重要作用。人细胞增殖相关激酶Prk（proliferation⁃related kinase），1996年由 WeiDai等首次克隆发现［2］，是Plks家族的新成员，现已命名为Plk3（polo⁃like kinase 3）［3］。Plk3在人类基因定位在1号染色体上，结构上分为激酶结构域和Polo盒结构域，其中Polo盒结构域发挥结合底物和细胞定位功能。研究发现Plk3恶性肿瘤的转化中发挥双面作用。在头颈癌［4］，肺癌［2］和肝癌［5］中，Plk3表达下调，并且与预后不良相关。而在卵巢癌［6］和乳腺癌［7］中，Plk3反而是表达上调，与预后不良相关。目前国内外尚未有关于Plk3在前列腺癌中的相关研究，其在正常前列腺以及前列腺癌组织中的表达情况尚不清楚。本研究拟通过免疫组化和病理参数相关性分析探讨Plk3蛋白在前列腺癌中的表达情况，并阐明其与临床病理学参数之间的关系。

“你……爸爸……”母亲的胸脯剧烈地起伏着：“……这个、这个……”母亲指了指床头柜。那里放着一个塑料袋，里面是一张发黄的剪报，以及一块玉佩。母亲看着儿子，安静地闭上了眼睛。

1 材料与方法

1.1 病人与组织标本

采取组织芯片进行免疫组化分析，组织芯片购买于西安艾丽娜生物科技有限公司，病例前均没有经过化疗或者放疗处理。组织芯片共80例样本，包含70例前列腺癌组织和10正常前列腺组织，其中样本a2和b1因免疫组化染色过程中受损而排除。

1.2 免疫组化分析

样本现在10%中性福尔马林中固定，然后石蜡包埋。石蜡切片厚度为4 μm，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，过氧化物酶对组织进行封闭，然后Plk3一抗（兔多克隆抗体，10977⁃1⁃AP，Proteintech Group，lnc.美国）4℃孵育过夜，稀释浓度1∶500。孵育二抗后DAB（中杉金桥）显色。每次的免疫组化过程中，不孵育一抗作为阴性对照。采用双盲方法对免疫组化染色强度进行评估，两者比较如有差异则再重新再评分以达到一致。400倍镜视野下取5个代表性视野数染色阳性细胞百分比和染色强度。总体评分方法为基于染色强度和百分比的半定量方法。染色强度评分方法：无色（0分），淡黄色（1分），棕黄色（2分），棕黄色（3分）。染色阳性细胞百分比评分方法：＜5%（0分），6～25%（1分），26～50%（2分），51～75%（3分），＞75%（4分）。染色强度评分和染色阳性细胞百分比评分相加为最后的免疫评分（immunoreactivity scores，IRS）。

1.3 GSEA分析前列腺癌中Plk3与增殖和转移的关系

从 TCGA 数 据 库（https：//cancergenome.nih.gov/.）下载498例前列腺癌患者的资料，根据平均值将其分为Plk3表达高和低两组，然后在GSEA软件（http：//www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）上分析与增殖和转移相关的基因集在Plk3表达高和低两组的富集情况。FDR q＜0.05为显著。

1.4 统计方法

我们对Plk3的表达水平和组织芯片的临床病理参数进行相关性分析。分析表明Plk3的表达水平和病理分级（P=0.048），临床分期（P＜0.001），淋巴结转移（P＜0.001）和远处转移（P＜0.001）有正相关关系（表1）。Plk3的表达水平与年龄和Gleason评分无相关关系。

根据楞次定律和毕奥-萨伐尔定律,空间载流电感线圈之间通过彼此的磁场相互联系的现象称之为电磁耦合[13]。根据该现象,一端固定电感线圈如果注入正弦交变激励,将在空间任一点产生磁感应,如果此时将一个带有另一电感线圈的LC谐振器靠近此电感线圈,将发生互感耦合,即在LC谐振器的内部也将感应到同频同相的正弦交变激励。

2 结果

2.1 前列腺癌及癌旁组织中Plk3的表达情况

为进一步研究Plk3在前列腺癌中发挥的功能，我们对TCGA数据库中498例前列腺癌患者的Plk3表达进行GSEA分析。结果表明与增殖和转移相关的基因集均富集在Plk3表达增高的组别（分别为 FDR q＜0.001和 FDR q=0.006）（见图 2），这说明了当前列腺癌中Plk3表达增高时，会引起与增殖和转移相关的基因发生显著的改变。

2.2 Plk3的表达水平与临床病理参数相关

采用SPSS 22.0软件（SPSS Inc，IL，USA）进行统计分析。通过Pearson χ2检验和Fisher确切概率法分析Plk3蛋白表达水平和临床病理参数的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.3 Plk3在前列腺癌的表达增加与增殖和转移有关

为了研究Plk3在前列腺癌中的表达情况，我们通过免疫组化芯片检测68例前列腺癌和10例前列腺正常组织中Plk3的表达情况。如图1A⁃F所示，Plk3在前列腺癌细胞浆中染色强阳性，在正常前列腺组织中度阳性。68例前列腺癌组织中，有19例（27.9%）是Plk3低表达，49例（72.1%）是Plk3高表达。并且前列腺癌组织中Plk3的表达水平显著比正常前列腺组织中的高（IRS：PCa=4.98±0.95 vs.Normal=4.30±0.82，P=0.034；T1-T2=4.55±0.90 vs.T3-T4=5.61±0.63，P＜0.001）（见图1B）。

3 讨论

前列腺癌根治术是目前最常用的手段，但是仍有近半数的病人发生术后PSA水平的升高，即生化复发［8］。经过初次治疗后，大约有16%～35%患者在五年后仍需要进行二次治疗［9］。但是，目前仍没有肿瘤标志物可以有效预测手术、放疗、内分泌治疗后的复发，因此有必要寻找更有效的前列腺癌诊断标记物来协助诊断、指导治疗和判断预后。

  

图1 Plk3在前列腺癌和正常前列腺组织中的表达 A：组织芯片68例前列腺癌组织Plk3免疫组化染色情况。B：前列腺癌组织与正常组织以及T3-4和T1-2前列腺癌组织中中Plk3表达水平统计学分析。C：T分期=Ⅳ，GS=3+4的前列腺癌中Plk3的表达情况。D：T分期=Ⅳ，GS=5+4的前列腺癌中Plk3的表达情况。E：T分期=Ⅱ，GS=2+1的前列腺癌中Plk3的表达情况。F：正常前列腺中Plk3的表达情况。*P＜0.05，**P＜0.01

Wendy等［10］报道Plk3对于细胞由G1期进入S期是必须的，Chase等［11］研究则表明Plk3可能参与细胞的G2/M期进程。同时Plk3也是一个多功能蛋白，最近有报道Plk3可通过磷酸化CtIP蛋白，在G1期促进双链断裂DNA的损伤修复［12］。Christina等则证明了Plk3通过促进CD95与配体的结合而激活 caspase⁃8，引起凋亡［13］。Yali等研究表明在缺氧条件下，敲除Plk3的表达使得HIF⁃1α更易诱导表达［14］。

Plk3作为Plk家族的成员之一，是有胞质分裂、丝分裂和DNA损伤反应的关键调节蛋白。Plk3的激酶活性在细胞周期的S晚期和G2期达到峰值，对细胞周期发挥关键的调节作用。细胞分裂间期Plk3一般定位于核膜周围，进入有丝分裂期后则定位于有丝分裂器如纺锤体上；另外Plk3还能够调节细胞的微管蛋白和微管组织中心，在控制细胞的形态发挥一定的作用。

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肿瘤复发来源于局部或者远处播散的残留细胞。而Plk3是周期相关蛋白，在细胞增殖中发挥重要作用。我们研究表明Plk3在前列腺癌中的表达水平比正常前列腺组织高，这与Plk3在卵巢癌和乳腺癌中的表达一致。卵巢癌病例中，超过50%Plk3表达阳性，并且相对于Plk3阴性表达的病例，其Ki67表达也相应增加［7］。而在乳腺癌的研究中，47.4%病例的Plk3表达阳性，而且Plk3的表达增加与更短的中位生存期和无复发生存相关［7］。但是也存在与这相反的研究报道。在肝癌中，Plk3的表达反而下降，与肝癌更短的生存期相关［6］，类似结果见于头颈癌［4］和肺癌［2］。从肿瘤分布类型来看，Plk3在癌中发挥促癌作用可能与性激素相关。前列腺癌的复发包括局部复发和远处复发，从我们的Plk3表达水平与临床病理参数的相关性分析显示，Plk3的表达水平与T分期，淋巴转移和远处转移正相关。这表明Plk3可能参与前列腺癌的转移进展。而目前报道Plk3参与肿瘤转移的研究不多，但也有研究表明Plk3可以通过抑制HIF⁃1α稳定性而抑制肿瘤血管的形成［15］，如前所述，Plk3发挥的作用因肿瘤类型而不同。另外根据我们对TCGA数据库中498例患者的Plk3的表达值的GSEA分析可知Plk3可能在增殖和转移方面影响前列腺癌的进展，这也与Plk3作为周期蛋白和我们的病理参数分析符合。不仅可能在增殖方面促进前列腺癌复发，还可能通过促进转移而引起前列腺癌的远处复发。

电阻率值为15.59～26.23 Ωm，声波时差为167.66～264.77 μs/m。砂岩视电阻率曲线多呈尖峰中低阻，自然电位曲线多呈宽浅凹形或“V”字型漏斗。

 

表1 前列腺癌患者中Plk3表达水平和临床病理参数的关系

  

注：“—”表示没有相关患者信息

 

临床特征组织癌正常年龄＜60≥60 Gleasonscore＜7≥7病理分级＜2≥2临床分期Ⅰ～ⅡⅢ～ⅣT分期T1-T2 T3-T4淋巴结转移N0 N1远处转移M0 M1组织芯片例数 低［例数（%）］ 高［例数（%）］P 68 10 19（27.9）7（70.0）49（72.1）3（30.0）0.013 13 37 3（23.1）8（21.6）10（76.9）29（78.4）0.596 32 34 12（37.5）7（20.6）20（62.5）27（79.4）0.129 14 52 7（50.0）12（23.1）7（50.0）40（76.9）0.048 40 28 19（47.5）0（0.0）21（52.5）28（100.0） ＜0.001 40 28 19（47.5）0（0.0）21（52.5）28（100.0） ＜0.001 46 22 19（41.3）0（0.0）27（58.7）22（100.0） ＜0.001 40 28 19（47.5）0（0.0）21（52.5）28（100.0） ＜0.001

  

图2 GSEA软件分析前列腺癌中Plk3表达水平与增殖（A）和转移（B）相关的基因集之间的关系“H”代表Plk3表达增高组，“L”代表Plk3表达减少组

本研究在前列腺癌中阐明了Plk3在蛋白表达水平作为肿瘤标志物的临床重要性。结合我们的研究结果和相关文献，我们认为Plk3对于前列腺癌的研究具有重要意义。Plk3可能通过在前列腺癌中过度表达而促进前列腺的增殖或转移，使其作为肿瘤标志物能有效预测前列腺癌的复发或成为肿瘤治疗的新靶点。

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