高效液相色谱法测定栀子中藏花素的含量

栀子黄色素是从植物栀子果实中提取的天然食用色素，其主要成分是藏花素，是一种较少见的水溶性类胡卜素色素。其水溶性好、着色力强，对光、酸、碱、盐等稳定性强，无毒性，已经广泛应用于工业染料和食品添加剂中[1-3]。

以栀子黄色素的色价和薄层色谱的Rf值为定性依据，1987、1988年我国连续颁布了栀子食品中栀子黄测定的国家标准[4-5]，并没有相关的定量标准。1982年，pfander等人首次应用HPLC测定藏花素含量[6]，而国内在此方面的研究较少。本研究采用高效液相色谱法，测定了栀子果实中藏花素的含量，方法稳定、快速、重现性好，旨在为栀子黄色素的定量分析提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)试验材料：栀子果，采于孝感市西河镇。

(2)主要仪器：高效液相色谱仪(美国戴安公司)，粉碎机(岛津仪器苏州有限公司)。

(3)主要试剂：藏花素标准品(中国药品生物制品检定所)，乙腈为色谱纯，超纯水。

1.2 样品的制备

1.2.1 栀子黄色素粗提液制备

准确称取标准藏花素标品1 mg，用甲醇∶乙腈∶水(17∶33∶50)溶解定容至100 ml，得到质量浓度为10 μg/ml标准溶液，储备于冰箱中备用。分别取上述标准溶液2、4、6、8、10 ml，用甲醇∶乙腈∶水(17∶33∶50)定容至100 ml，得到体积分数为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/ml标准溶液

1.2.2 样品的纯化

利用HPD-400型大孔树脂和直径为5 cm的层析柱，借助泵的作用，进行动态吸附和梯度洗脱。试验中先用蒸馏水洗脱树脂柱上被吸附的部分栀子苷和绿原酸，然后依次用体积分数为10%、20%、30%的乙醇洗脱栀子苷，再用体积分数为80%的乙醇作为洗脱溶液，以1.5 ml/min速度洗脱树脂柱上的栀子黄色素，得到样品液，用HPLC直接测定，结果见图1。

  

图1 栀子黄色素的解吸曲线

1.3 藏花素标品配制

将栀子果用粉碎机粉碎成粉，取栀子粉10 g放入250 ml圆底烧瓶中，按1∶10比例加入体积分数为70%的乙醇100 ml，在60℃水浴中浸提6 h，抽滤即得栀子粗提液。

1.4 色谱条件

为了获得良好的分离效果，本试验采用了甲醇、乙腈、水3种溶剂的混合液作流动相，并对这3种溶剂的不同配比进行研究，试验结果表明，当甲醇、乙腈、水的体积比为17∶33∶50时，样品中的藏花素与其他成分分离效果较好(见图3和图4)，保留时间为1.900 min。

2 结果与分析

2.1 最佳波长的选择

取藏花素标准溶液于150～500 nm范围内进行紫外可见光扫描，扫描结果见图2。由图2可知，在440 nm处有最大吸收峰值，因此，藏花素检测波长确定为440 nm。

  

图2 藏花素的吸收光谱

2.2 流动相的选择

XBridge Amide氨基柱(250×4.6 mm，粒径5 μm)，以甲醇∶乙腈∶水(17∶33∶50)为流动相，流速为1.0 ml/min，检测波长为440 nm，柱温：25℃，进样量为10 μl。

  

图3 藏花素标准品出峰色谱图

  

图4 藏花素样品出峰色谱图

2.3 标准曲线

取已经配制好的0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/ml藏花素的标准溶液各10 μl，经微孔过滤后，按照上述的色谱条件进样，并记录不同浓度下藏花素的标准样品溶液对应的峰面积积分值。以藏花素吸收峰面积(y)对质量浓度(x,μg/ml)进行线性回归，得回归方程：y=1.508 7x-0.014 1，相关系数R2=0.996 2。测定结果见表1。

[1] 付小梅，赖学文，葛 非.中药栀子类药材资源调查和商品药材鉴定[J].中国野生植物资源，2002，21(5)：23-25.

 

表1 藏花素标准溶液的色谱数据

  

质量浓度/μg·ml-1峰面积积分值0.20.31370.40.58630.60.87210.81.14121.01.3941

2.4.1 仪器精密度

3、提高林业资源保护模式的先进性和灵活性。相关政府部门应正确认识到重视林业资源管理工作的重要意义，转变对林业资源管理工作的轻视心理或者敷衍态度，通过采用现代化的林业资源保护方法来提高林业资源管理工作水平和工作效果。相关政府部门还应引导林业企业树立大局意识和长远意识，实现获取眼前经济效益到获取长远效益的转变，实现林业结构的优化升级，对于部分企业存在的恶意使用林业资源的行为进行严厉处罚。

在上述色谱条件下，将浓度为1.0 μg/ml的藏花素标准品连续进样5次,测其峰面积，并换算为相应的含量(测定值)，记录及换算结果见表2。

根据表2记录数据，计算峰面积积分值对应含量(测定值)的相对误差=0.001 5%，其相对误差值在5%以下,说明该方法检测藏花素精密度良好。

纠正孕产妇及其家属对重男轻女思想的错误认识,为孕产妇提供详细、全面的关于选择分娩方式的知识,观察孕产妇的心理情绪变化以及家庭和睦情况,疏解其焦虑、抑郁等不良心理情绪,树立自然分娩的自信心。

1.1.2 CKD分期标准 1期：肾脏损伤，GFR正常或升高：GFR≥90 mL/（min·1.73 m2）；2期：GFR轻度下降：GFR在60～89 mL/（min·1.73 m2）；3a期：GFR轻到中度下降：GFR在45～59 mL/（min·1.73 m2）；3b期：GFR中到重度下降：GFR在30～44 mL/（min·1.73 m2）；4期：GFR重度下降：GFR在15～29 mL/（min·1.73 m2）；5期：肾衰竭：GFR＜15 mL/（min·1.73 m2）或透析。

 

表2 精密度测定试验

  

质量浓度μg·ml-1峰面积积分值测定值μg·ml-1相对误差%11.52551.020511.52001.016811.52401.01950.001511.52531.020311.52311.0189

2.4.2 方法精密度

分别取栀子果5份，按照样品的制备方法制成样品溶液5份，各进样10 μl(5次平行)，记录峰面积积分值，由标准曲线计算藏花素的含量,结果见表3。

 

表3 样品的测定结果

  

进样序号峰面积积分值藏花素含量g·(100g)-1平均含量g·(100g)-1相对误差%11.02730.172621.0230.171931.01980.17130.17170.05941.01870.171151.02150.1716

2.5 重复性

取同一批栀子黄色素样品，按照样品制备方法配制5份，分别进样10 μl，记录每次进样时，样品溶液对应的峰面积积分值，并换算为相应的含量(测定值)，记录及换算结果如表4所示。

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表4 重复性实验结果

  

进样序号峰面积积分值测定值μg·ml-1相对误差%11.02510.688821.01920.684931.02480.68860.002241.01780.684051.02090.6860

针对温度上升，作物蒸腾加速、水分损失增多、干旱发生几率加大的情况，采用先进的滴灌、喷灌、渗灌、微灌等技术，减少无效蒸散和渗漏，提高作物的水分利用效率。

2.6 稳定性

取1.2.2节中制取的栀子黄色素样品10 μl，按照上述色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，并记录下不同时刻，栀子黄色素样品溶液对应峰面积积分值及保留时间，并将积分值换算为含量(测定值)，记录及换算结果见表5。

 

表5 稳定性试验结果

  

进样时间h峰面积积分值测定值测定值的相对误差/%保留时间min保留时间的相对误差/%01.02770.69051.9121.01930.6851.91341.02120.68621.910.001881.02530.68890.00231.908121.02030.68561.912241.01990.68541.911

吸取一定量的藏花素标准液(质量浓度为1.0 μg/ml)，加入到已知藏花素含量的样品中，按1.4节进行测定，结果见表6。

2.7 加标回收率

根据表4记录数据，计算出其峰面积积分值对应含量(测定值)相对误差=0.002 3%，保留时间相对误差=0.001 8%，其相对误差值均在5%以下，这表明制备好的栀子黄色素样品溶液在24 h以内具有较好的稳定性。

由表4可知，峰面积积分值对应含量(测定值)的相对误差=0.002 2%，这表明在本实验所用的高效液相色谱条件下的测定具有很高的重复性。

 

表6 回收率实验结果

  

原样品藏花素的含量/μg标准品加入量/μg测得藏花素的含量/μg回收率%平均回收率/%相对误差%458.8597458.998458.9198.297.680.729458.8496.8458.9298.4

由表5可知，藏花素含量平均回收率为97.68%，相对误差为0.729%，表明此方法测定栀子中藏花素的含量准确、可靠。

保山市隆阳区丙麻乡属于山区，本地不出产煤炭，煤炭外购成本高昂，加之近年来地貌恢复和植树护林形势严峻。烟叶烘烤对于燃料的需求大，新鲜烟叶8～10 kg才可烤出来1 kg干烟，对于近2 000 t的种烟乡，每年的燃料需求量巨大，可以说燃料成本已成为当地烤烟生产的重要支出。因此，能耗问题与行业发展、地方财税与烟农增收的矛盾越来越激烈。

3 结果与分析

以藏花素为标品，在流动相为甲醇∶乙腈∶水(17∶33∶50)、检测波长为440 nm、进样速度1.0 ml/min、柱温20℃条件下，测定的藏花素含量的线性方程为：y=1.508 7x-0.014 1，相关系数R2=0.996 2。加样回收率为97.68%，相对误差为0.729%。该方法较为简单、经济，且结果可靠、稳定、重现性、精密度和回收率都较好，可作为栀子中藏花素含量的测定方法。

[参考文献]

结果表明，藏花素溶液在0.2～1 μg/ml范围内，峰面积与进样浓度呈良好的线性关系。

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[3] 车双辉，杜琪珍，钟立仁.栀子成分的开发研究进展[J].天然产物研究与开发，2002，14(5)：57-59.

[4] 中华人民共和国林业部.食品添加剂栀子黄(粉末、浸膏)的测定：GB7912-87[S].北京：中国标准出版社.

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[7] 胥秀英，郑一敏，傅善权，等.效液相色谱法测定大枣中卢丁的含量[J].食品科学，2004，14(5)：57-59.

本装置整体为钢结构组成，单列底架及活动小车承载总重70.4吨，底架、轨道梁、上层活动小车框架承载强度及变形量需经有限元分析计算。经分析计算，下层底架的最大应力小于150MPa，变形量为0.80mm。活动小车框架最大应力220MPa，变形量为1.06mm。整体结构应用有限元分析进行了优化改进，刚度、强度均满足钢结构承载要求。

（1）制定验收制度。对容易出现问题的施工节点制定验收制度，减少出现钻井施工问题的可能性。如二开固控设备验收制度、水平井下FEWD验收制度、沙河街地层验收制度等，实现问题的提前处理。

[8] 王 敏，魏益民，高锦明，等.反相高效液相色谱法测定苦荞中的芦丁和槲皮素[J].中国食品学报，2005，5(3)：113-116.

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[9] 陈建中，葛水莲，杨明建，等.加速溶剂萃取-高效液相法测定方便面中栀子黄色素[J].食品科学，2016，37(10)：208-212.