脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物免疫亲和柱的研制

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又称呕吐毒素，是一种单端孢霉烯族真菌毒素；其乙酰化衍生物主要有3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-Ac-DON)和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-Ac-DON)两种，大约占谷物中总DON量的10%左右[1]。

DON及其乙酰化衍生物主要由镰刀菌属产生，理化性质稳定[2]。联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)已将DON确定为最危险的自然发生食品污染物之一[3]，国际癌症研究中心(IARC)于1993年将其列为三类致癌物[4]。3-Ac-DON和15-Ac-DON作为隐蔽型DON，在体内会水解为毒素单体，被认为毒性与DON相当，其污染水平在评估人类DON实际膳食暴露量时具有重要指导作用[5-6]。国标[7]和出入境检验检疫行标[8]中规定采用色谱法检测谷物及食品中的DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON三项；虽然色谱法具有准确度、精密度和灵敏度高的优点，但需要强有力的样品前处理技术，以达到富集净化、降低基质噪音的目的。

免疫亲和柱(IAC)是基于抗原抗体可逆性结合为原理，将目标物从样品中分离出来，同时完成净化与浓缩，具有操作简便、特异性强、净化彻底等优点[9]。目前关于真菌毒素IAC制备，多采用单一抗体制备单一毒素IAC[10-12]，仅杨婷婷等采用3种抗体制备了黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和DON多合一免疫亲和柱[13]。虽然应用DON及其乙酰化衍生物的IAC进行液相或者液质测定已有报道[14]，但包括国标[7]在内，对DON及其乙酰化衍生物的IAC均未作出性能评价要求。

2.4.6 稳定性试验 取“2.2.4”项下经预处理的米索硝唑pH敏感脂质体溶液适量，分别在室温下放置0、2、4、6、12 h时，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，米索硝唑峰面积的RSD为1.55%（n＝5），表明经预处理的米索硝唑pH敏感脂质体溶液在室温下放置12 h内基本稳定。

本文以实现DON及其乙酰化衍生物被同时净化为目的，通过制备两种不同特性的单抗、以蛋白A-琼脂糖凝胶为载体定向偶联制备大容量IAC，并对其进行性能评价，为商品化IAC评价技术规范的制定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

All data were analyzed with statistical software(SPSS v13.0;SPSS Inc.,Statistics for Windows,Chicago,IL,USA).Data are the mean ± standard deviation(x¯± s)using an analysis of variance,followed by the least significant difference test.P＜0.05 was considered statistically significant.

细胞株SW-3 F4、SW-3 G12，由江苏省苏微微生物研究有限公司实验室，通过免疫原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞杂交融合，筛选得到的能稳定分泌抗呕吐毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株；雌性BALB/c小鼠，购自扬州大学比较医学中心；小鼠单抗亚类鉴定试剂盒均购自美国Proteintech公司。

DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON的标准品，购自美国Sigma公司；胎牛血清和小牛血清，购自杭州ExCell Bio公司；DMEM培养基，购自HyClone Laborotories公司；牛血清白蛋白(BSA)，购自美国Sigma；羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶标二抗，购自无锡药明康德；96孔酶标板，无锡耐思；蛋白A-琼脂糖凝胶(平均粒径90 μm)，购自美国GE Healthcare公司；二甲基庚二亚胺二盐酸盐(DMP)、石蜡、弗氏完全、不完全佐剂，购自美国Sigma公司；甲醇(色谱纯)，购自德国Merck公司；其余试剂均为分析纯；实验用水均为超纯水。

1.1.2 仪器

总而言之，钢贸企业财务管理中成本控制至关重要，在复杂的国际环境和激烈的国内竞争中，钢贸企业想要取得良好的经济收益就必须要采取有效手段控制成本。

Cintra 10e 紫外-可见分光光度计，澳大利亚GBC。LC-20AT；液相色谱仪(含RF-20Axs)，日本岛津；Athena C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美国Waters；HS-3垂直混匀器，宁波新芝；DYY-6C型电泳仪，北京六一；ZKY-1001型真空泵，上海嘉鹏；砂芯漏斗，如东砂芯；CO2培养箱，赛默飞世尔；CJ-2F型医用净化工作台，苏州冯氏；934-AH玻璃纤维滤膜(直径11 cm)，英国Whatman；DW-HL328型-80 ℃冰箱，中科美菱；酶标仪，美国biorad。

1.2 实验方法

1.2.1 抗DON单克隆抗体的腹水制备、纯化及鉴定

自《临床神经病学杂志》创刊伊始，慕容慎行教授即一直关心并支持我刊工作，为我刊的进步做出了卓越的贡献。先人已去，风范长存，我刊在深切缅怀慕容慎行教授的同时，将以他严谨治学的精神激励自己，奋勇进取。慕容慎行教授，我们永远怀念您！

(4)标品加标回收率

取SW-3 F4和SW-3 G12细胞，采用小鼠腹腔注射细胞诱导腹水，具体参考Chu等的操作步骤[14]。分别记腹水1和腹水2，-20 ℃保存备用。

1.2.1.2 腹水纯化

分别取腹水1和腹水2，采用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化[16]，得到初步纯化后的抗体1和抗体2，过0.22 μm无菌滤膜，分装并-70 ℃保存备用。

(4)目前的实验室测量工作量大、耗时长，中间过程和操作需要严格培训和按标准执行，尤其是恒温条件的控制需要加强；同时，加强实验室黏度计的使用和测量条件的统一和标准化，这样才能得到准确的测量值，千万避免出现“为测而测”的现象。

1.2.1.3 抗体鉴定

根据《大学英语教学指南》对大学英语教学目标划分为两个等级；基础和提高。首先对新生开展分级教学，分成两个级别，即A班和B班。其次，系部针对不同级别的学生，分别制订不同的教学目标、大纲、内容及评价。并且根据分级的标准，合理地进行课堂管理和师资的配备[3]，对学生进行形成性评价。再次，每个学期都要对学生进行流动分级考试，执行动态管理机制，保证各级别学生能够通过努力，实现自己的学习目标，并针对自己特长和兴趣，有方向性地进行学习。

(1)浓度和纯度：分别取1 mL抗体1、2溶液，过蛋白A亲和层析柱，甘氨酸-HCl(pH 3.0)洗脱层析柱上的结合单抗，收集流出、洗脱。紫外分光光度法分别测定上样液和洗脱液中的蛋白质量浓度[17]，并结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法鉴定抗体的蛋白质分子量和纯度[18]。计算公式如下：

技术的飞速发展已经开始改变人类历史几千年的文明惯性和生活惯性，且这种改变将加速到来。人工智能的社会效应，既可能极善，也可能极恶。前者是大同或天堂;后者是新奴隶社会或人类毁灭，且不可逆。如何对待这种不确定性?在找到预防和控制其负面效应的手段之前，人类是否应该轻易地发展人工智能?

蛋白质量浓度(mg/mL)=1.45×A280 nm-0.74×A260 nm

抗体纯度(%)=

%

(2)亚型鉴定：取上述亲和纯化的抗体1和抗体2，依照小鼠单抗Ig类/亚类鉴定试剂盒的说明书操作，进行亚型鉴定。

(3)交叉反应率：准确称取DON、3-Ac-DON和 15-Ac-DON的标准品，用甲醇分别配制成0.1 mg/mL的储备液。准确移取标准储备液，用磷酸盐缓冲液稀释成浓度依次为50 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL和1 000 ng/mL的工作液。参照单克隆抗体活性鉴定技术规程[19]，分别测定抗体1、抗体2对DON及其乙酰化衍生物的交叉反应率。

2.1.2 交叉反应率和单抗亲和常数测定

故意性会计信息失真为国家制定发展计划和宏观经济调控政策提供了错误依据，造成与实际情况不符，使得行业与行业、地区与地区之间的资金流向混乱，导致行业和地区投资不足或重复投资，甚至更为严重的社会问题。故意性失真的会计信息的直接后果是造成市场资源配置效率低下，扰乱公平竞争市场秩序的罪魁祸首，严重阻碍我国市场经济有序运行。

1.2.2 IAC的制备

取纯化后的抗体1、抗体2，按照一定质量比混匀，加入至20 mL处理好的蛋白A-琼脂糖凝胶中，其它步骤参照文献[17]。反应结束后装柱，即0.25 mL胶/支(3 mL柱)，4 ℃沉降过夜后，装好上下筛板及堵头，2 ℃～8 ℃冰箱保存备用。

以图3、图4曲线50%抑制百分率的质量浓度IC50计算交叉反应率，得到抗体1与DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON的交叉反应率分别为100%、0.1%和453%；抗体2与DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON的交叉反应率分别为100%、101%和6%。测定结果表明，抗体1对DON和15-Ac-DON表现出高度的特异性，抗体2对DON和3-Ac-DON表现出高度的特异性，亲和常数分别为3.0×108 L/mol 和2.0×109 L/mol，均大于108 L/moL，对于DON乙酰化衍生物的捕获形成良好的互补性。

色谱柱： Sepax C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流动相：梯度洗脱，0～6 min：15%乙腈水；6～8 min：30%乙腈水；8～15 min：5%乙腈水；15～23 min：5%乙腈水；23～28 min：15%乙腈水；28～30 min：15%乙腈水。流速0.8 mL/min；进样量20 μL；柱温35 ℃；紫外检测：波长220 nm。

1.2.4 IAC的性能评价

(1)非特异性吸附

指亲和柱被过量上样时，样品中的待测物除可与特异性抗体结合外，还可与琼脂糖基质或杂蛋白发生非特异性吸附作用，通常用非特异性吸附率来表示。按文献[18]所述方法测定空白柱对3种毒素DON、3-AC-DON及15-AC-DON的非特异性吸附率。每个实验做3个平行。

(2)柱容量

指每毫升凝胶对应待测物的最大吸附量(ng/mL)。取制备好的3支IAC柱(0.25 mL胶/3 mL柱)，分别用3种毒素的单标溶液和混标溶液过柱；20 mL水洗除杂；1 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，HPLC检测各毒素的浓度。每个实验做3个平行。

第一，个人演唱会的举办，是一个歌手（含组合）的能力及人气的展现和证明。流行歌手（含组合）举办个人演唱会一般在其成名之后。具有满足演唱会时长（大多为2.5小时左右）的歌曲曲目积累（20首以上），被广泛认可的艺术成绩，以及相当程度的票房号召力，是歌手举办演唱会的前提。因此，个人演唱会常被视为对歌手（含组合）的最高挑战。[10]

(3)柱空白

随机抽取同一批次的IAC 3支，去保护液，10 mL超纯水淋洗2次，2 mL甲醇洗脱，HPLC测定洗脱液中3种毒素的含量，考察在标准品出峰时间附近是否有本底干扰。每个实验做3个平行。

1.2.1.1 腹水制备

由图6可知，柱空白洗脱液在8.858 min位置处有DON目标峰，说明亲和柱有一定本底干扰。收集10支柱空白洗脱液，氮吹后用1 mL甲醇溶解，测定其平均本底空白为86 ng/0.25 mL凝胶。

(5)基质加标回收率

以阴性的小麦为基质，按GB 5009.111进行提取，提取液分别加入不同浓度水平的DON混标，取适当体积控制DON总量在小于柱容量的范围内进行过柱，2 mL纯甲醇洗脱，HPLC法测定；取未加标的空白提取液进行空白对照测定。分别计算基质加标回收率：

回收率

2 结果与讨论

2.1 抗体鉴定

2.1.1 浓度、纯度测定和亚型鉴定

为保证蛋白浓度测定的准确性，以0.01 M PBS缓冲液为空白对照测定上样前的蛋白浓度，以0.2 M醋酸(pH 4.4)与0.5 M Tris(pH 8.5)混合缓冲液为空白对照测定酸洗后的蛋白浓度。通过计算，得到纯化抗体1和抗体2的蛋白浓度分别为5.0 mg/mL和8.1 mg/mL，单抗纯度分别为100%和94.0%。进一步采用SDS-PAGE电泳表明，抗体1溶液(泳道2)和抗体2溶液(泳道3)，均含有约57 KD的重链和约25 KD的轻链；两条清晰的轻、重链条带表明酸洗蛋白基本为纯单抗，单抗2中略含有一定的杂蛋白，见图1。

  

图1 抗体1和抗体2的SDS-PAGE电泳图

图2的结果表明，两种抗体的亚型均为IgG1，抗体1轻链为λ链，抗体2轻链为K链。

  

图2 抗体1和抗体2的亚型鉴定

(4)单抗亲和常数：参照万文徽[20]方法进行。

1.2.3 HPLC测定条件

2.2 免疫亲和柱的性能评价

2.2.1 非特异性吸附

全椒县扶贫干部洗澡没接到电话就被通报处分一事发生后，国家行政学院教授竹立家接受记者采访时表示，这是“对人格权缺少尊重，也是对执纪处罚权缺乏敬畏”。此语可谓一针见血。各种不切实际、不近情理的指令之所以源源不断地出台，是因为官僚主义作祟；而下级工作者明知其不合理，却战战兢兢只能执行，生怕牙迸半个不字就得付出代价。可人再能干，时间精力也终究有限，于是形式主义便成为应对各种指令的利器。久而久之，连合理的指令也只能收获形式主义的答卷了。

因为无法在亲和柱上直接测定待测物的非特异性吸附量，所以考察Blank柱(以蛋白A-琼脂糖凝胶直接装柱)对待测物的吸附作用。结果表明，蛋白A-琼脂糖凝胶载体对DON及其衍生物的非特异性吸附率分别为2.3%，0和0，而洗脱量几乎为0，说明凝胶载体对于小分子DON及其衍生物有一定截留。可能是因为在测定过程中，去杂液和洗脱液浓度太低，低于HPLC检出限30 g/L而 无法被检测到，从而被误认为存在非特异性吸附。

作为“胚胎生物化学之父”的李约瑟博士(Joseph Needham，1900～1995)怎么会从生物化学的研究，转向中国古代科技史的研究呢？原来，1937年剑桥大学来了三位攻读博士学位的中国留学生——沈诗章、鲁桂珍和王应睐。他们的到来改变了李约瑟的生活轨迹，使他将后半生献给了对中国古代科学与文明的研究，撰写了多卷本巨著《中国的科学与文明》，充分显示了他对中国古代技术成就的景仰。李约瑟回顾三位中国学生对他的影响：“其一，他们激励我学习他们的语言；其二，他们提出了这样一个问题——为何当代科学只是发源于欧洲？”[1]

  

图3 抗体1与DON、3-Ac-DON及15-Ac-DON的抑制

  

图4 抗体2与DON、3-Ac-DON及15-Ac-DON的抑制

2.2.2 柱空白

石警官笑了一下，笑容里丝毫不带奸猾的意思，这使得刘雁衡的心，往更深的暗井坠下去。一般地说，容易被激怒的人，往往比较容易对付。

由图5可见，DON标品的目标峰在8.859 min位置处、 3-Ac-DON的目标峰在18.109 min位置处、15-Ac-DON的目标峰在17.116 min位置处。

  

图5 DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON混标的HPLC色谱图

以不同浓度的DON、3-AC-DON及15-AC-DON混合标准品过免疫亲和柱，2 mL纯甲醇洗脱，HPLC法测定洗脱液含量，分别计算不同浓度的标品加标回收率。每个实验做3个平行。

  

图6 三合一亲和柱柱空白洗脱液的HPLC色谱图

为避免柱空白带来的对测定值的影响，偶联单抗的凝胶先通过甲醇预处理，然后再进行装柱。装柱后的柱容量比未处理前有下降；但放置1周时间后，柱容量又恢复至未处理前的90%左右，并且柱空白洗脱液中的DON浓度为0(见图7)，基本不影响后续使用。

继续上述的文献计量法，如果Node types选择keyword，CiteSpace软件运行后的可视化图谱呈现，模块值(简称Q值)为0.7517，平均轮廓值(简称S值)为0.7155。一般而言，当S值在0.5以上，聚类一般认为是合理的；当S值在0.7时，聚类是令人信服的；Q值一般在区间[0,1)内，Q>0.3就意味着生成的网络结构是清晰的。因此，就Q值和S值而言，本次聚类都较为有效合理。[14]聚类后发现，国内学界对新汉学中的政治学研究成果的关注主要集中在以下五大热点问题。

2.2.3 柱容量

根据表1的HPLC测定结果，以单标上样为例，DON、3-Ac-DON和15-AC-DON的平均柱容量分别为3 243 ng、1 285 ng和1 527 ng，并且在3项指标上表现出良好的重复性(0.40%

  

图7 预处理后的三合一亲和柱柱空白洗脱液的 HPLC色谱图

 

表1 单标上样和混标上样柱容量的比较(n=3)

  

过柱方式名称柱容量/(ng/0．25mL胶)柱1柱2柱3平均值RSD/%DON32313256324132430．40单标上样3-AC-DON12791293128212850．6015-AC-DON15541502152415271．68DON32013243322932240．66混标上样3-AC-DON13101292128212951．1015-AC-DON15871555150315482．74

2.2.4 标品加标回收率

在低于柱容量水平上测定标准品的回收率。分别取不同体积DON/3-AC-DON/15-AC-DON混标溶液(配制溶剂为20%甲醇-水)，过三合一免疫亲和柱(0.25 mL/3 mL柱)，其余步骤同柱容量测定。计算不同上样量时亲和柱对每种毒素的平均回收率，结果如表2所示。

DON上样量分别为240 ng、600 ng、1 200 ng时回收率在93.8%～100.5%之间(RSD≤2.1%)；3-AC-DON上样量分别为160 ng、400 ng、800 ng时回收率在91.3%～98.6%之间(RSD≤3.7%)；15-AC-DON上样量分别为200 ng、500 ng、1 000 ng时回收率在90.8%～97.5%之间(RSD≤3.3%)；回收情况良好，重复性一致。

 

表2 不同浓度标品过柱的回收率(n=3)

  

名称上样量/ng平均回收率/%RSD/%24093．81．6DON60094．61．71200100．52．116091．33．53-Ac-DON40092．53．780098．62．820090．83．315-Ac-DON50097．53．1100095．41．9

2.2.5 基质加标回收率

在阴性小麦样品提取液中添加3种浓度的混标，过免疫亲和柱后，HPLC法分别测定回收率，结果如表3所示。数据表明该亲和柱在高、中、低毒素含量时，吸附和洗脱毒素的效果均较理想。3种毒素各浓度平均加标回收率均大于89%，即便低浓度加标(DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON分别加标量为100 μg/kg、50 μg/kg、50 μg/kg)，DON及其乙酰化衍生物的回收率均达到90%以上，提示对于低含量样品净化时，亲和柱对其基本无截留。

 

表3 小麦基质添加不同浓度混标的回收率(n=3)

  

名称加标质量浓度/(g/kg)平均实测质量浓度/(g/kg)平均回收率/%RSD/%10093．593．55．6DON500456．591．34．71000928．792．97．55045．190．26．13-Ac-DON250231．592．63．7500457．091．47．05046．292．35．815-Ac-DON250222．889．14．1500451．590．35．2

2.2.6 稳定性

将制备出的DON三合一亲和柱置于2 ℃～8 ℃保存，每隔一定时间测定一次相对柱容量，观察柱容量的变化，结果如下图8所示。三合一亲和柱的柱容量在保存的前3个月内几乎没有变化，3个月后开始慢慢降低，保存12个月后，最终柱容量仅比初始柱容量下降约20%左右，表明保存过程中DON及其乙酰化衍生物的相对柱容量均表现出良好的稳定性。

  

图8 三合一亲和柱相对柱容量随时间的变化曲线(n=3)

3 讨论

由杂交瘤细胞株SW-3 F4、SW-3 G12获得抗体1和抗体2两种特性的单抗，虽亚型相同，但对DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON的交叉反应形成良好的互补，从亲和常数Ka上看都在108～109 L/mol，一般认为中等亲和力的抗体可用作亲和层析的配基，以避免强力洗脱时纯化物质的损伤。

邓舜洲研制的DON免疫亲和柱，采用CNBr活化的琼脂糖4FF胶作为偶联载体，属随机偶联方式[21]，而本文采用的是蛋白A-琼脂糖凝胶作为偶联载体，属定向偶联方式[22]。前者免疫亲和柱的柱容量为1 000 ng/0.5 mL(=2 000 ng/mL)[12]，本文免疫亲和柱的柱容量为3 243、1 285和1 527 ng/0.25 mL(=12 972、5 140、6 108 ng/mL)，两者相差数倍。这种差异是由于随机偶联方式其靠近抗体的结合位点指向有碍与毒素结合的空间，因此抗体与毒素的结合力较差[21]；而定向偶联方式使单抗的FC端始终朝向蛋白A，另两个分叉部位则一致朝外，充分暴露在与毒素结合的方向，因此有效提高了抗体与毒素的结合容量[23]。

本文采用抗体1和抗体2制备的三合一IAC有一定量的柱空白，但在凝胶载体、交联剂及缓冲溶液中并未发现含有DON，推测此柱空白可能来自于抗体中的DON。因为研究人员发现[24-25]，DON经小鼠代谢在血浆、组织中都有广泛分布，且正常的小鼠经24小时基本排出体外。经检测，饲喂的鼠粮中DON平均含量在0.8～1.0 mg/kg，因单抗的制备采用的是小鼠腹腔注射细胞分泌形成，推测游离DON通过血管、肠道等途径进入腹腔与抗体形成复合物，并逐渐累积。是否可以通过饲喂含一定量毒素脱霉剂，来减少DON暴露量，进而消除抗原抗体结合物的累积，还需进一步的研究。

国际食品添加剂联合专家委员会(JECFA)于2010年确定DON及其乙酰衍生物总和的每日容许最大摄入量为1.0 μg/kg/d，欧盟正在考虑将目前执行的单一DON限量标准修订为DON及其衍生物(包括隐蔽型)之和[26]。因此跟踪国际新标准，将我国现行食品中针对DON单一限量修订为DON及其衍生物之和为大势所趋。本文及时顺应该趋势，研制出了DON、3-Ac-DON和15-Ac-DON三合一免疫亲和柱，并评价了其性能，为现行的两大测定呕吐毒素及其乙酰化衍生物国家标准[7-8]提供了强有力的样品前处理手段，这对提升我国的真菌毒素检测水平，具有一定的促进意义。

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