CCR6-CCL20轴在口腔扁平苔藓黏膜组织中的表达及意义

口腔扁平苔藓(oral lichen planus, OLP)是一种在口腔黏膜疾病中有较高发病率的自身免疫性疾病。它主要的病理特征是上皮过度不全角化、基底层液化变性及固有层密集的淋巴细胞浸润[1-2]。目前研究认为，OLP发病与免疫相关，而包括趋化因子及其受体配体在内的T淋巴细胞的异常迁移与募集是OLP的主要发病机制[3]。然而，T淋巴细胞异常密集的机理仍不清楚[4]。

趋化因子(chemokines)是一类能使细胞发生趋化运动的小分子，与其同源受体结合后可活化和趋化白细胞，在组织局部感染、炎细胞的趋化运动、免疫应答、肿瘤的生长和转移等众多生理病理过程中发挥重要作用[5]。CCR6是一种G蛋白偶联的趋化因子受体,特异性表达在Th17表面[6-7]。CCL20是CCR6的唯一配体，可由上皮细胞、内皮细胞、树突状细胞、T细胞等分泌[8-9]。CCL20表达水平可由TNF-α、IL-17、IL-6调控，并在内环境维持稳态[10-12]。同时，CCR6可以通过与CCL20结合介导细胞的迁移和促进炎症。CCR6-CCL2轴已经被证实在类风湿关节炎、哮喘及牛皮癣等免疫疾病中发挥重要作用[13-16]，为探讨它与口腔扁平苔癣发病机制的潜在关联，本实验对CCR6、CCL20在OLP黏膜组织中的表达进行研究。

1 材料与方法

1.1 样本收集

30例口腔扁平苔藓样本取自2015年12月至2016年8月间就诊于本院黏膜科的患者，其中男11例，年龄30～65岁；女19例，年龄26～65岁，均符合WHO诊断标准[17]，通过临床表现及病理科证实。20例正常口腔黏膜标本作为对照组，来源于外伤患者颊黏膜、无明显炎症的阻生牙拔除术或种植手术标本的牙龈组织，年龄19～65岁。所有患者均无其它系统性疾病，且最近3个月未受任何治疗。该试验获南京医科大学伦理学委员会批准，并征得所有受试者的同意。

采集2组口腔黏膜组织，所取的组织分为两部分:一半经PBS液(Gibco公司，美国)冲洗后快速冷冻并转移至-80 ℃保存用于荧光实时定量PCR；另一部分则用福尔马林和石蜡处理后用于免疫组化检测。

1.2 材料

Tri-Reagent(Sigma公司)，PrimeScriptTMRT Master Mix逆转录试剂盒(TaKaRaBiotechnlogy公司)，荧光定量PCR 试剂盒(TaKaRaBiotechnlogy 公司)，无水乙醇、氯仿(上海国药集团化学试剂有限公司)，兔抗人CCL20 多克隆抗体(Ⅰ抗，Abcam,ab9829,英国)，兔抗人CCR6 多克隆抗体(Ⅰ抗，Abcam,ab78429，英国)，DAB 显色剂 (迈新生物技术有限公司，福建)，抗兔即用型MaxVisionTM 试剂(迈新生物技术有限公司，福州)，3%H2O2溶液(白云药业有限公司，南昌)。

4.4.2 颗粒物浓度预报月变化。从图25～图30可以看出，模式预报颗粒物浓度的月变化呈现峰谷峰的趋势。

1.3 方法

存在为了保证财政拨给高等院校的运营经费不留余额和下年度运营经费的预算额度考虑，财务部门往往会将项目（课题）报销支出的经费串户从财政零余额账户资金或财政直接支付账户支付，截留了项目（课题）课题经费。

那是个繁星的夜，李青山发着疯了！他的哑喉咙，使他讲话带着神秘而紧张的声色。这是第一次他们大型的集会。在赵三家里，他们像在举行什么盛大的典礼，庄严与静肃。人们感到缺乏空气一般，人们连鼻子也没有一个作响。屋子不燃灯，人们的眼睛和夜里的猫眼一般，闪闪有磷光而发绿。

正常口腔黏膜中，CCR6在上皮层中弱表达；在口腔扁平笞藓病损组织中，CCR6在上皮基底层中呈阳性表达，在淋巴细胞浸润强阳性表达。正常口腔黏膜中，CCL20在上皮层中弱表达，固有层几乎无表达。在口腔扁平笞藓病损组织中，CCL20在上皮层中及淋巴细胞浸润层均呈阳性表达，图3。

1.4 统计学分析

CCL20 mRNA在口腔扁平苔藓病损中的表达(2.52±0.32)明显高于对照组(0.45±0.09)，具有统计学差异(P<0.000 1),图2。

1.3.2 免疫组化 石蜡组织备成4 μm的切片，经过脱蜡、水化、冲洗后，柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)微波加热修复抗原20 min。PBS漂洗3次，切片滴加过氧化物酶阻断试剂，室温下孵育10 min，再PBS清洗。滴加用1% BSA稀释过的第一抗体，阴性对照用PBS代替，4 ℃冰箱过夜。第一抗体稀释比例：CCL20是1∶200，CCR6 是1∶50。 切片清洗后，滴加1滴或50 μL即用型MaxVisionTM /HRP试剂，室温下孵育15 min。DAB溶液处理，镜下观察显色，苏木素复染，梯度乙醇，脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜拍摄染色照片，每张切片在200倍镜下随机选取5个不重叠的视野分别测量CCL20及CCR6的累积光密度值(integrated optical density,IOD)，取其均数作为每张切片的CCL20及CCR6的累积光密度值。

2 结 果

2.1 OLP组织中CCR6 mRNA的表达

免疫组化图像分析结果表明，CCR6和CCL20在OLP患者组织中的表达均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.000 1，P<0.000 1)，图4～5。

  

图1 CCR6 mRNA在OLP及正常组织中的相对表达Fig.1 CCR6 mRNA level in oral tissues

1.2 OLP组织中CCL20 mRNA的表达

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。利用t检验分析实验组和对照组黏膜组织中CCR6、CCL20的表达差异，P<0.05有统计学意义。

1.3.1 荧光实时定量PCR 根据Tri-Reagent总RNA提取试剂盒说明书提取组织RNA。再采用PrimeScriptTMRT Master Mix逆转录试剂盒，在反应温度条件37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s下获取cDNA。引物按照说明书分装和稀释，按照下列要求与冰上配制反应液：SYBR Green(含ROX)10 μL；上游引物0.4 μL；下游引物0.4 μL；cDNA1.8 μL；灭菌ddH2O 7.2 μL。以GADPH为内参，在7300 ABI Real-time PCR仪上进行PCR反应。所有反应重复3次。CCR6：F:5′-TTGTACCGATTGCCTACTCCTT -3′；R:5′-CCCAGAATGGGAGTAAAGAAC -3′。CCL20：F:5′-GCTGTACCAAGATTTGCTCCT-3′；R:5′-ATTGATGTCACAGCCTTCATTG-3′。GAPDH：F:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’；R:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt 方法表达目的基因相对定量分析[18]。

  

图2 CCL20 mRNA在口腔扁平苔藓及正常黏膜组织的相对表达量Fig.2 CCL20 mRNA level in oral tissues

2.3 CCR6/CCL20在黏膜组织中的免疫组化检测

勾股定理是几何学中的明珠，它是联系数与形的第一定理，它推动了数学的发展，在几何学中有非常广泛的应用.微课程介绍历史上中西方发现勾股定理的故事，传递中国古代数学家们对于勾股定理的发现在世界数学史上的独特的贡献和地位，激发民族自豪感和学习兴趣.

CCR6 mRNA在口腔扁平苔藓病损中的表达(2.58±0.37)明显高于对照组(0.29±0.07),有统计学差异(P<0.000 1)，图1。

  

A:正常黏膜阴性对照；B：CCR6在正常黏膜中低表达；C:CCR6在口腔扁平苔藓病损组织中高表达；D:口腔扁平苔藓病损组织阴性对照；E:CCL20在正常黏膜中低表达；F:CCL20在口腔扁平苔藓病损组织中高表达A: negative control of normal oral mucosa; B: week expression of CCR6 in normal oral mucosa; C: strong expression of CCR6 in OLP tissue; D: negative control of oral tissue; E: weak expression of CCL20 in normal oral mucosa; F: strong expression of CCL20 in OLP tissue

 

图3 CCR6和CCL20的免疫组化结果( ×200)Fig.3 Immunohistochemical staining of CCR6 and CCL20( ×200)

  

图4 CCR6蛋白在对照组和实验组表达水平Fig.4 Expression of CCR6 protein in oral tissues

  

图5 CCL20蛋白在对照组和实验组表达水平Fig.5 Expression of CCL20 protein in oral tissues

3 讨 论

OLP是一种病因不明的自身免疫性疾病，研究表明，趋化因子受体表达的异常，可以影响相应趋化因子对T细胞的功能影响[19-21]。Th17 细胞是不同于Th1和 Th2的CD4+T 细胞，且参与免疫及炎症性疾病的发病[22]。近期越来越多实验研究Th17在OLP的机制中发挥的作用。Shaker等[23]在OLP的唾液中检测到高表达的IL-17, Monteiro等[24]发现OLP组织病损中IL-17及IL-23表达增高，除此之外，相关研究较少。而CCR6作为特异性表达在Th17细胞表面的趋化因子受体，具有重要的研究意义，可作为重要因子与其配体CCL20诱导信号传递，从而影响OLP发病。

本研究中,我们通过检测CCR6和CCL20在口腔扁平苔藓病损组织中的表达，探讨CCR6-CCL20轴在OLP的局部病损发病过程中的潜在作用。结果显示，OLP口腔黏膜组织中CCR6、CCL20的mRNA表达量明显高于正常黏膜。此外，我们通过免疫组化检测CCR6/CCL20的蛋白表达和定位，研究发现，CCR6在正常对照组上皮层中弱表达；而在OLP病损组织中，CCR6在上皮层中呈阳性表达，且在淋巴细胞浸润层强阳性表达。CCR6的配体，CCL20在正常组织的上皮层低表达，在固有层无表达；而在OLP病损组织中，上皮层及淋巴细胞浸润层中均有明显高表达。这表明CCR6-CCL20参与了OLP的免疫应答，在发病中有着重要的作用。

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研究表示，炎症相关因子的异常表达与OLP免疫失衡有关，如IL-1β、TNF-α，且这些细胞因子可刺激趋化因子的产生，从而促进白细胞浸润到损伤部位形成炎症。许多自身免疫性疾病，如多发性硬化、类风湿关节炎、银屑病，它们的发病与辅助性T细胞(Th细胞)的浸润密切相关。CCR6是Th17细胞表面的特异性受体，可与CCL20相结合传递信号介导细胞迁移和调控炎症，且 CCR6可以介导Th17细胞的组织特异性迁移[7,25-26]。CCL20是CCR6的唯一配体，可由上皮细胞、内皮细胞、树突状细胞、T细胞等分泌产生，并能受IL-1β、TNF-α等炎症因子的调节[8-11]。在口腔扁平苔藓中，由于炎症因子的刺激，上皮细胞分泌CCL20增多，CCL20通过与CCR6结合招募更多的免疫细胞到炎症病损组织，起始并促进免疫应答。同时，高表达的CCR6一方面促进T细胞的趋化性，激活并诱导其迁移，另一方面与CCL20相互作用促进炎症因子的释放介导炎症，且形成正反馈，产生局部组织病损。

本研究显示， CCR6-CCL20轴在OLP病损组织的发病过程中，可能发挥较为重要的作用，这为OLP的病因及临床治疗靶点提供新的思路。

[参 考 文 献]

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