川续断皂苷VI对大鼠正畸牙周组织改建影响的研究

川续断是一种经典活血化淤及补肾的中草药，有促进骨折愈合、强骨补肾的作用[1]。前期实验表明灌服川续断有利于大鼠正畸牙移动加快[2]。但由于川续断的成分繁复，其中的成分作用很难明确，故川续断中何种成分能够促进牙移动及如何促进牙移动等问题均不清楚。以往研究显示，川续断皂苷VI(asperosaponin D，ASD)是川续断中的活性成分之一(图1)，因此，本研究通过在大鼠正畸牙移动模型局部注射ASD，可更加准确地研究其对正畸牙牙周组织改建的作用机制。本研究旨在研究局部注射不同浓度ASD，并以前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)为阳性对照、以生理盐水为阴性对照，采取抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色观察压力侧牙周组织中破骨细胞的数量，选择免疫组化染色观察压力侧破骨细胞分化因子(osteoclast differentiatian factor，ODF)的分布情况，进一步研究ASD对破骨细胞的作用及影响正畸牙移动的机制，为临床工作中实现正畸牙高效移动的愿望，提高正畸治疗疗效，探索缩短正畸治疗疗程的新方法。

  

图1 川断续皂苷VI化学结构式Fig.1 The chemical structure of asperosaponin D

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用40只6 周龄雌性Wistar大鼠(由山东大学新药评价中心提供)，体质量180～200 g，饲养于山东大学新药评价中心清洁级动物室，投喂消毒粉末状固体饲料，适应性饲养1周后放置加力装置，加力后投喂软食。

1.2 实验试剂和仪器

前列腺素E2 (北京泰德制药股份有限公司)；木通皂苷D(上海宝曼生物科技有限公司)；镍钛螺旋拉簧(直径0.304 8 mm，有研亿金新材料股份有限公司)；正畸用测力计(807-006型，3M，美国)；游标卡尺(精确度0.02 mm)；光学显微镜(DM4000b， LEICA，德国)；图像采集系统(QwinV3，LEICA，德国)。

1.3 方法

1.3.1 实验分组(见表1) 40只大鼠随机分为4组(每组10只)：A组注射生理盐水，B组注射低浓度ASD，C组注射高浓度ASD，D组注射前列腺素E2。

选择和使用时，明确图画书是与课文、其他文学作品不同的课程资源，尝试用同一个图画书文本应用于不同的课程计划。

 

表1 实验设计与动物分组Tab.1 Experimental design and animal grouping

  

组别注射量浓度力值/N加力间隔/d给药间隔/dA组0．2mL0．9%0．004172B组5mg/kg5g/L0．004172C组10mg/kg10g/L0．004172D组25μg/kg0．025g/L0．004172

以均数±标准差来表示数据，数据处理选择SPSS 13.0统计软件，分析方法组间比较选择单因素方差分析，而多个样本间的两两比较，检验水准均以α=0.05，P< 0.05为有统计学意义。

  

图2 矫治器加载Fig.2 The orthodontic appliance

拉簧加力第1天起注射药物，局部注射部位在上颌第一磨牙近中腭侧黏骨膜处，每2 d注射1次。药物注射剂量：A组大鼠注射生理盐水(NS)0.2 mL，B组局部注射较低浓度ASD溶液(5 mg/kg)，C组局部注射较高浓度ASD溶液(10 mg/kg)，D组则以局部注射适宜浓度的PGE2溶液(25 μg/kg)(表1)。实验期间，每12 h监测大鼠矫治器稳定情况，若发现安装的拉簧脱落则及时重新安装。实验中处置动物遵守《关于善待实验动物的指导意见》。

在临床工作中成人正畸患者不断增多，成人患者对于相对较短的治疗周期、快速的正畸治疗有着更强烈的愿望。而且长时间的正畸治疗有很多不良的后果，会增加患者发生龋坏、牙根外吸收以及牙周疾病的风险[3]，患者的依从性也会降低，减少这些不利后果的最好的方法便是加快正畸牙齿移动的速度。因此，正畸医生致力于研究加快正畸牙移动并且不良反应小的方法，希望可以缩短正畸治疗疗程，尽量减少正畸治疗时间长的危害。

  

图3 剥离的大鼠上颌骨Fig.3 Skull of a wistar rat after OTM

(6)在PCB走线方面,大电流环路面积尽量小,走线尽可能粗,降低走线阻抗,减小PCB走线引起的寄生参数对电路的干扰,尽可能使控制信号、驱动信号不被寄生参数所影响。

媒体报道称，一项报告显示，共享经济已经扩展至中国全国，2017年的交易额达到4．92万亿元，比上年增长47%。正因为此，大公司和中国政府正在力推这个经济潮流，认为它是推动经济发展的力量。据预测，到2020年，共享经济规模将占到中国国内生产总值（GDP）的10%，而在2015年这一数字仅为3%。

1.4 统计学方法

1.3.2 实验模型的建立及各组的处理(表1) 大鼠腹腔注射2 %盐酸氯胺酮(2 mL/kg)麻醉，制取上颌模型，委托技工中心制作大鼠上中切牙铸造金属带环。再次腹腔注射2%盐酸氯胺酮(2 mL/kg)麻醉，粘接带环，以两上中切牙为支抗，将不锈钢结扎丝(直径为0.20 mm)从大鼠上颌第一磨牙与第二磨牙间穿过，于两侧上颌第一磨牙与同侧切牙带环之间放置镍钛拉簧(直径为0.304 8 mm)，调节拉力为0.004 1 N，每7 d加力1次(图2)。

图6可以看出在上颌第一磨牙近中压力侧ODF的表达明显，ODF表达沿着牙周膜排列呈链状。ODF值测定选择图像分析软件Image-pro plus6.0，分别测定组动物第3、7、14、21、28天5个时间点压力侧牙周膜ODF表达的平均光密度值(图7)，结果显示：ODF的表达与时间成相关性，从第7天到第21天，ODF不断增加，在第28天时降低。ODF的表达情况与TRAP染色的破骨细胞计数情况基本一致。

2 结 果

2.1 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色结果

图4表明各组3、7、14、21、28天这5个时间点矫治力压力侧均分布TRAP阳性细胞，其数量有一定差异。在各组内TRAP阳性细胞随时间延长增加，在第21天时达到最高峰，随后开始降低(表2，图5)。在加力第3天，各组破骨细胞计数差别无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组(A组)相比加力第7天时C、D组的破骨细胞数目均显著增多。C组和D组与A组相比均有显著差异(P<0.05)，而A组和B组的破骨细胞基本相似无统计学差异(P>0.05)。加力第14、21、28天时，各实验组(B、C、D组)较对照组(A组)破骨细胞数目均显著性增加(P<0.05)；与阳性对照PEG2组(D组)相比，A、B组破骨细胞数目均显著性减少(P<0.05)，C组破骨细胞数目也减少但是差异无统计学意义(P>0.05)；与C组相比，A组与B组破骨细胞数目均减少且具有统计学(P<0.05)。

一是水利建设投资再创新高，重点水利项目建设全面加快。截至2013年11月，国家下达兵团的各类中央水利建设项目投资333 308万元，较2012年同期增加77 335万元，增幅为30.2%。其中中央投资257 648万元，增幅为17.2%。水利建设投资的增长确保了水利工程建设速度的全面加快。中哈霍尔果斯河友谊联合引水枢纽工程全面完工，乌勒昆乌拉斯图河水资源配置及186团节水改造工程、多浪水库除险加固工程已基本完工，玛纳斯河肯斯瓦特水利枢纽工程已完成全部任务的80%。2013年国家下达兵团的水利建设项目95%已开工，通过采取综合举措，水利投资计划执行进度较2012年大幅度跃升。

  

a:与A组(NS)相比,P<0.05;b:与D组(PGE2)相比,P<0.05;c:与C组(ASD高浓度组)相比,P<0.05

 

图4 牙周组织破骨细胞数目Fig.4 The number of osteoclasts on the pressure side

 

表2 大鼠移动牙压力侧破骨细胞数Tab.2 Osteoclasts number in the pressure side of alveolar bone

  

组别3d7d 14d 21d 28d A组2．47±0．053．33±0．06c7．61±0．04c9．75±0．03c8．86±0．06cB组2．46±0．033．34±0．02bc8．03±0．03abc10．01±0．03abc9．34±0．05abcC组2．47±0．023．49±0．04a8．29±0．05a10．12±0．04a9．46±0．03aD组2．48±0．033．51±0．02a8．33±0．03a10．13±0．05a9．44±0．02a

 

注：a:与A组(NS)相比P<0.05；b:与D组(PGE2)相比P<0.05；c:与C组(ASD高浓度组)相比P<0.05

2.2 免疫组化染色结果

“现在不少基层医院、县医院、地级医院，无论是规模还是装备配置，都已经非常领先，他们不缺硬件，缺的恰恰是软件，是规范的管理。”何斌指出，省医院下一步将利用医联体平台和协会平台，向更多基层医院辐射关于医学装备全生命周期的相关管理经验。

  

a：牙槽骨；p：牙周膜；r：牙根；黑色箭头：破骨细胞 A组：对照组；B组：ASD低浓度组；C组：ASD高浓度组；D组：前列腺素E2组a：alveolar bone；p：periodontium；r：root；black arrows：osteoclast A：control group；B：a low concentration ASD injection group；C:a high concentration ASD injection group; D:an appropriate concentration PGE2 injection group

 

图5 正畸牙周组织TRAP染色( ×400)Fig.5 Periodontal tissue with TRAP staining ( ×400)

  

a：与A组(NS组)相比，P<0.05；b：与D组(PGE2组)相比，P<0.05；c：与C组(ASD高浓度组)相比，P<0.05

 

图6 4组动物不同时间点牙周膜中ODF平均光密度值分布条图Fig.6 Determination of average optical density of ODF in rats’ periodontium

  

p：牙周膜；r：牙根 A组：对照组；B组：ASD低浓度组；C组：ASD高浓度组；D组：前列腺素E2组p：periodontium；r：root A：control group；B：a low concentration ASD injection group；C:a high concentration ASD injection group; D:an appropriate concentration PGE2 injection group

 

图7 正畸牙周组织免疫组化染色( ×400)Fig.7 Periodontal tissue with immunohistochemical staining( ×400)

3 讨 论

1.3.3 标本制取及组织学观察 建立正畸力学刺激模型后的第3、7、14、21和28天时，采用腹腔注射过量水合氯醛的方法对大鼠进行麻醉，随后进行大鼠心脏灌注，取大鼠上颌骨，4%多聚甲醛固定大鼠上颌骨第一磨牙及其周围牙槽骨，每批次每组2只。组织标本(图3)于4 ℃外固定24 h，4 ℃10%乙二胺四乙酸( ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA)溶液中脱钙3个月(每3 d换1次脱钙液)。将标本固定、脱水、包埋，将组织块切成沿牙体长轴、沿近远中向制备成4 μm厚切片,后行TRAP染色观察破骨细胞数目，及免疫组化染色观察ODF的表达情况，观察磨牙近中压力侧的组织改建情况。

TRAP染色：TRAP染色阳性细胞呈粉红至深红色。每组每时间段2张切片，除牙根的压力侧根尖1/3区域以外，每张切片分别随机取选择5个具有TRAP染色阳性细胞的高倍镜头( ×400)，彼此不重叠，切片的破骨细胞总数是5张镜下破骨细胞数的总和，采用算术平均数的方法得到分组中的破骨细胞总数。免疫组化染色：ODF棕黄色细胞为阳性细胞，主要在破骨细胞的胞膜和胞质中大量表达。选取每组各时间段的两张切片，每张切片除牙根压力侧根尖1/3区域外分别随机选取10个视野( ×400)进行光密度值测量，选择图像分析软件Image-pro plus6.0，测定4组动物各时间段牙周组织压力侧ODF表达的平均光密度值。

正畸牙移动的基础是牙周膜受到持续矫治力后牙周组织改建，牙周组织的改建是一个复杂、多因素共同作用的过程，简而言之是破骨细胞的破骨活动与成骨细胞的成骨活动相互协调、共同作用的结果[4]。牙齿受到矫治力后，牙周膜内血流改变从而改变牙周膜的微环境，导致不同炎性介质比如生长因子、细胞因子、激素、神经递质、花生四烯酸代谢产物等分泌，导致压力侧牙周组织中破骨细胞被激活牙槽骨发生吸收，张力侧牙周组织中成骨细胞被激活从而牙槽骨形成，进而牙齿在牙槽骨中可以发生位置移动[4]。维持牙周组织改建和牙槽骨骨改建的平衡需要依靠这些因子调节成骨细胞、破骨细胞的活性[5]。因此，可以推论能影响成骨细胞、破骨细胞分化与活性的药物均可以改变牙移动的速度。

川续断的功效主要有：补肝肾、强筋骨、续折伤等[1]。2015年，《中国药典》指定川续断皂苷VI(akbiasaponin D，ASD)为川续断科植物川续断(Dipsacus asper Wall.ex Herry)的含量测定标准即确定ASD是川续断的主要活性物质，川续断能增加骨密度，抵抗骨质疏松[1]。研究表明，ASD 与阿尔茨海默病[6-7]、心血管疾病[8]、肝病[9-10] 、骨质疏松[11]等多种疾病相关。ASD通过Akt/NF-κB通路减弱β-淀粉酶引起的阿尔茨海默病的认知障碍和记忆障碍，从而有助于治疗阿尔茨海默病[7]。ASD通过减少急性心肌梗死大鼠的乳酸脱氢酶、谷氨酸的丁酮二氨基转移酶和血清心肌肌钙蛋白T而保护心脏免受缺血损伤[8] 。有研究显示，川续断皂苷Ⅵ可以显著促进正常的大鼠骨髓基质干细胞和取自骨质疏松大鼠的骨髓基质干细胞的增殖、分化，促进成骨标志蛋白碱性磷酸酶、骨保护素的表达，有利于成骨细胞的成熟[11-12]。川续断皂苷可通过上调Bcl-2 和下调caspase-9、 caspase-3、Bax的表达来抑制软骨细胞的凋亡，进而起到治疗骨关节炎的作用[13]。综上所述，我们选取ASD作为实验药物，研究其对大鼠正畸牙齿移动的作用，以进一步明确川续断在正畸牙移动的主要机制，以期为口腔正畸临床探索一种高效、经济、不良反应小的加快牙移动的方法。

PG(前列腺素)作为与临床正畸牙移动的体内体外实验广泛研究的药物，分类中主要相关的是PGE1、PGE2和PGF。PG作为一种由环氧酶作用于花生四烯酸产生的生物活性因子，在牙周膜细胞中通过内分泌的方法产生而作用于正畸牙移动过程中牙周改建及骨改建。牙齿受到正畸力后，牙周组织细胞感受到机械力刺激合成并分泌PGE2，从而激活腺苷酸环化酶，同时增加了细胞内ATP外流速度，细胞内cAMP浓度升高从而促进RANKL的表达而使牙周膜细胞向破骨细胞分化，进而出现牙槽骨吸收，最终导致正畸牙移动[14-15] 。也有研究表明， PGE2可刺激牙周膜干细胞和骨髓基质干细胞中RANKL 的表达，从而刺激破骨细胞的生成。PGE2是重要的中介，可通过抑制牙周膜干细胞和骨髓基质干细胞的成骨分化而促进骨吸收[16-17]。PG也受到细胞因子如白介素-1、体内钙离子浓度等多种因素影响进而影响牙槽骨改建，该过程是一种复杂的生物连锁反应[18-19]。国内外研究均表明：PG和正畸牙移动(orthodontic teeth movement,OTM)关系十分密切，低浓度PGE2有利于维持牙周膜内环境稳定，过高的则说明牙周组织处于急性炎症状态，故只有适宜浓度PG才能加快正畸牙移动[20-21]。因此，本研究选取对于牙移动作用比较肯定的局部注射适当浓度的PGE2当做阳性对照，与ASD对大鼠正畸模型牙齿移动的作用进行比较，可以更清晰明了地阐述ASD促进正畸牙齿移动的作用机制。

正畸牙齿移动过程中破骨细胞分化是一个非常关键的环节，故如何促进破骨细胞分化也备受重视。ODF作为一种破骨细胞抑制因子/骨保护素的配体，介导了破骨细胞的分化、粘附和活化，进而影响骨改建过程[22]。目前研究表明，前体骨细胞是通过细胞膜上ODF的表达来激活破骨分化的[23]。因此，ODF的表达分布情况与破骨细胞分化密切相关，希望通过免疫组化观察正畸牙移动过程中牙周组织ODF的表达，进一步阐明ASD对破骨细胞分化的影响，探究其加速牙周组织改建的原理。通过上述实验结果，我们可以得出在受到矫治力后，PGE2可以促进破骨细胞分化的结论，与学者研究相符[24]，低浓度及高浓度ASD局部注射同样可以促进破骨细胞的形成，但高浓度的ASD效果更佳，与PGE2效果相似。

综上所述，局部注射ASD对于大鼠正畸压力侧破骨细胞形成有推动作用，有助于增进牙周改建和加速正畸牙移动。但其具体机制、不良反应及注射剂量等问题尚未明确，故对其尚需进一步研究。

[参 考 文 献]

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社, 2015:55.

[2] 席兰兰，王媛，颜淑云，等. 灌服川续断水煎液对大鼠正畸牙移动及牙周组织中破骨细胞的影响[J]. 上海口腔医学，2010，19(4)：410-414.

[3] Hechang H, Williams RC, Kyrkanides S. Accelerated orthodontic tooth movement:Molecular mechanisms[J]. Am J Orthod Dentofacial Orthop,2014,146(5):620-632.

[4] Kitaura H, Ishida M, SugisawaH, et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane[J]. Sci World J,2014,2014:617032.

[5] Jiang C, Li Z, Quan H, et al.Osteoimmunology in orthodontic tooth movement[J]. Oral Dis, 2015, 21(6):694-704.

[6] Xing Y, Linna W, Lin M, et al. Akebia saponin D attenuates ibotenic acid-induced cognitive deficits and pro-apoptotic response in rats:involvement of MAPK signal pathway[J]. Pharmacol Biochem Behav,2012,101(3):479-486.

[7] Yu X, Wang LN, Du QM, et al.Akebia Saponin D attenuates amyloid beta-induced cognitive deficits and inflammatory response in rats:involvement of Akt/NF-кB pathway[J]. Behav Brain Res,2012,235(2):200-209.

[8] Li C, Liu Z, Tian J, et al. Protective roles of asperosaponin VI, a triterpene saponin isolated from dipsacus asper wall on acute myocardial infarction in rats[J]. Pharmacol, 2010，627(1/3):235-241.

[9] Gong LL, Wang ZH, Li GR, et al.Protective effects of Akebia sa-ponin D against rotenone-induced hepatic mitochondria dysfunction[J]. Pharmacol Sci, 2014, 126(3):243-252.

[10] Gong LL, Li GR, Zhang W, et al. Akebia saponin D decreases hepatic steatosis through autophagy modulation[J]. Pharmacol Exp Ther,2016,359(3):392-400.

[11] Ke K, Qi L, Yang X, et al. Asperosaponin VI promotes bone marrow stromal cell osteogenic differentiation through the PI3K/AKT signaling pathway in an osteoporosis model[J]. Sci Rep,2016,6:35233.

[12] 张云辉，刘成成，祝爱珍，等. 木通皂苷D通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路促进大鼠骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞[J].中国病理生理杂志，2012，28(8)：1455-1460.

[13] Li XR, Jian L, Qiang R, et al. The molecular mechanism of treating osteoarthritis with dipsacus saponins by inhibiting chondrocyte apoptosis[J]. Exp Ther Med, 2017, 14(5):4527-4532.

[14] Silvola AS,Varimo M, Tolvanen M, et al.Dental esthetics and quality oflife in adults with severe malocclusion before and after treatment[J].Angle Orthod,2014,84(4):594-599.

[15] Xu Y, Shen J, Muhammed FK, et al. Effect of orthodontic force on the expression of PI3K, Akt, and P70S6 K in the human periodontal ligament during orthodontic loading[J].Cell Biochem Funct，2017，35(7):372-377.

[16] Krishnan V, Sanford RL, Davidovitch Z, et al. Effects of prostaglandin E2 on clonogenicity, proliferation and expression of pluripotent markers in human periodontal ligament cells[J]Semin Orthod，2017,23(4):373-381.

[17] Ern C, Berger T, Frasheri I, et al. Differentiation of hMSC and hPDLSC induced by PGE2 or BMP-7 in 3D models[J].Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 2017，122:30-37.

[18] Rajasekaran UB, Krishna Nayak US. Effect of prostaglandin E1 versus corticotomy on orthodontic tooth movement:an in vivo study[J]. Indian J Dent Res,2014,25(6):717-721.

[19] Caglaroglu M,Erdem A. Histopathologic investigation of the effects of prostaglandin E2 administered by different methods on tooth movement and bone metabolism[J]. Korean J Orthod, 2012,42(3):118-128.

[20] Mostafa YA， Weaks-Dybvig M, Osdoby P. Orchestration of tooth movement[J].Am J Orthod，1983, 83(3):245-250.

[21] Truntipakorn A, Makeudom A, Sastraruji T, et al. Effects of prostaglandin E2 on clonogenicity, proliferation and expression of pluripotent markers in human periodontal ligament cells[J].Arch Oral Biol,2017,83:130-135.

[22] 黄琳,郑铭豪,丘钜世,等.破骨细胞分化因子及生成抑制因子[J].中国骨质疏松杂志，1999，5(2)：81-84.

[23] Yasuda H, Shima N, Nakagawa N, et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95 (7):3597-3602.

[24] Celebi AA, Demirer S, Catalbas B,et al. Effect of ovarian activity on orthodontic tooth movement and gingival crevicular fluid levels of interleukin-1β and prostaglandin E2 in cats[J].Angle Orthod, 2013, 83(1):70-75.