无牙颌患者口腔菌群组成的焦磷酸测序分析

牙列缺失后，定植于牙齿表面的细菌因丧失栖息场所而发生一定程度的改变[1-2]。有研究表明，全部牙齿丧失会改变口腔细菌的类别和数量[3-4]。以往观点认为，定植于天然牙表面的牙周致病菌，如牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌等，会随着牙列缺失而消失。但有学者通过分子杂交法发现，个别牙周致病菌依旧生长在佩戴义齿者的口腔内[5-6]。牙列缺失后，咀嚼功能大大降低，对唾液腺刺激功能亦显著下降，唾液分泌及流量的减少会影响口腔细菌定植，进而影响口腔菌群的组成。然而，对无牙颌患者口腔菌群组成的研究目前仍鲜有报道。

随着我国桥梁建筑技术的不断提高，现代桥梁朝着薄壁、大跨、轻型的方向发展。而桥墩作为桥梁的重要结构，为了能更好地适应现代桥梁特点的需要，改变了以往粗、大、实的结构，转向轻型、薄壁、高强、注重造型的方向发展，其中薄壁空心高墩是一种较好的形式[1]。

由于航天发射场特种装备具有需求差异大、非批量研发的特点,多数情况下是根据任务的具体需求对基型设备的改型设计,其次是全新设备开发,设备重复生产情况较少.设备改型设计是在成熟设备的基础上,根据任务需求与发射场现有设备存在的差异之处,对设备的相关可变型结构进行改型设计,并进行任务需求的个性化修改设计.

焦磷酸测序技术(pyrosequencing)应用广泛，涉及古生物学、海洋生物学、人类学以及癌症、传染病等多个研究领域[7-8]。焦磷酸测序技术所获得的基因片段大小约200 bp，在细菌微生态研究中，可针对细菌16S rRNA(核糖体RNA)基因序列的可变区进行分析，是分析口腔菌群物种丰富度的有效方法之一[9-10]。本研究拟采用高通量的焦磷酸测序技术，对11例无牙颌患者口腔菌群的群落结构进行解析，综合、全面地探究其口腔菌群组成。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2009年1月至2010年2月在上海第九人民医院口腔修复科就诊的11例健康无牙颌患者，年龄60～65岁。牙列缺失6个月暂未修复，口腔粘膜健康、无厚重舌苔；3 个月内无抗菌素使用史；排除口腔异味、呼吸系统疾病、消化系统疾病、实质性脏器损害以及糖尿病、嗜烟酒史。实验对象知情并签署知情同意书。

1.2 实验材料与设备

棉试子基因组DNA试剂盒(Tiangen，上海)，击打器(Scientific Industries,美国),ND-1000紫外分光光度计(NanoDrop, Thermo，美国)，UV GIS-2008凝胶成像系统(天能，上海),454 Life Science GS FLX测序仪(国家基因组南方中心，上海)。

1.3 实验方法

根据引物标签将序列分类，每类序列构成一个不同样本来源的独立文库。采用Clustal X 1.83软件进行DNA同源序列排列，并经人工仔细核查。将所有待分析序列集中在一个“.FASTA”格式文件中，Clustal X软件导入该文件后执行Alignment，保存输出为“.aln”格式文件。采用Jalview 2.07软件进行序列编辑，导入“.aln”格式文件，按照“16S rRNA序列同源性大于97%属同一种，同源性大于95%属同一属，同源性大于80%属同一门”的原则，将cut-off 值设定为3%。所有验证后序列划分为不同的操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)，每个OTU有其代表序列。

1.3.2 粘膜菌斑标本收集 收集餐后2 h的口腔粘膜菌斑。无菌双蒸水漱口3次后，无菌棉球隔离唾液，无菌棉拭子擦拭口底/舌腹、舌背、唇颊前庭、硬腭/牙槽嵴顶处粘膜，收集粘膜菌斑，每个位点反复擦拭10次以保证菌量，置于Eppendorf管中。同时取一个无菌棉拭子置于Eppendorf管中作为空白对照。

1.4.2 不同位点菌斑样本的细菌16S rRNA基因PCR扩增和基因文库序列测定 16S rRNA的扩增引物针对V2-V3可变区第339-539位碱基(大肠杆菌 357F, 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3'; 518R, 5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')。为了区分不同样本来源的序列，每份样本均设计一枚8个碱基的引物标签。不同样本来源的DNA分别进行PCR 扩增。序列分析时尽量使各样本的扩增产物在总体系中比例相同，确保每份样本的总DNA量大于2 μg。采用454 Life Science GS FLX测序仪进行焦磷酸测序。

1.4 构建细菌16S rRNA基因文库

11例无牙颌患者口腔菌群16S rRNA 基因文库测序共获得51 091条16S rRNA 基因序列，其中能够在GeneBank 中找到匹配一致性达97%或在RDP 数据库中找到匹配分值≥0.873的序列共分为239个OTUs。26 554条序列135个OTUs是可培养的标准菌种；7 156条序列68个OTUs是可培养的非标准菌种。17 381条序列36个OTUs是PCR获得的16S rRNA 基因序列，目前尚无法培养。11例无牙颌患者口腔菌群的菌门分布如图1所示，239个OTUs主要分布于厚壁菌门 (Firmicutes)、变形菌门 (Proteobacteria)、拟杆菌门 (Bacteroidetes)、放线菌门 (Actinobacteria)。

1.3.3 样本保存 所有样本收集后立即-80 ℃冻存。

分析11例无牙颌患者不同口腔位点的菌群组成发现，定植于口底/舌腹、舌背、唇颊前庭、硬腭/牙槽嵴顶、唾液中最多的菌种均为缓症链球菌，序列数量最多的前5种优势菌见表3。

1.5 生物信息学分析

1.3.1 唾液标本收集 收集餐后2 h的全唾液。无菌双蒸水漱口3次后取约3 mL唾液于Eppendorf管中。同时取1 mL无菌双蒸水于Eppendorf管中作为对照。

11例无牙颌患者口腔中均检测到的菌属有10个(表1)，共41 710条序列，占总序列数的81.6%，包括：链球菌属 (Streptococcus)、孪生菌属 (Gemella)、韦荣氏菌属 (Veillonella)、颗粒链菌属 (Granulicatella)、奈瑟菌属 (Neisseria)、嗜血杆菌属 (Haemophilus)、假单胞菌属 (Pseudomonas)、卟啉单胞菌属 (Porphyromonas)、普氏菌属 (Prevotella)、罗氏菌属 (Rothia)。

将OTUs代表序列通过Genbank、RDP 数据库作比对。对于不确定序列，应用数据库的Sequence Match程序检索与其代表克隆匹配值最高的序列作为参比序列。如参比序列一致性低于97%或匹配分值低于0.873，则应用NCBI网站的BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)查询有无最新登录的更佳参比序列。

2 结 果

2.1 无牙颌患者口腔菌群的门水平分析

1.4.1 提取细菌总DNA 采用基因组DNA提取试剂盒提取不同位点菌斑样本DNA：采样玻璃珠打击法破除细菌壁，在400 μL溶液中加入40 mg 直径0.1 mm氧化锆/硅质小珠，合上盖子后置于击打器上进行击打处理，室温下采用2 500 r/min涡旋击打1 min。ND-1000紫外分光光度计测定DNA的浓度、纯度。UV GIS-2008凝胶成像系统记录结果，核实DNA 的实际浓度。

从新生代农民工个体来看，他们受教育程度较高，具有发展自己的强烈愿望，渴望融入城市社会，对教育培训有迫切的需求；从社会层面来看，新生代农民工群体对技术和素质要求较高的工作岗位望而却步，但他们又不想从事劳动强度大、收入低的工作，这在一定程度上阻碍了他们融入城市社会的目标。而教育培训具有提升新生代农民工群体素质、提高其就业能力与人力资本的作用，能有效的促进新生代农民工融入城市社会；从国家层面来看，加强新生代农民工的教育培训有利于更好的解决新生代农民工问题，以及国家在城市化、现代代与工业化中遇到的问题，维护社会稳定与和谐。

  

图1 11例无牙颌患者口腔菌群的菌门分布Fig.1 Phyla distribution profile of the oral flora from 11 edentulous subjects

2.2 无牙颌患者口腔菌群的属水平分析

借由情绪教育促进心理健康的方式极为多元，其中，通过阅读方式舒缓情绪压力，自我调适负面情绪，以找回内在的挫折复原力，即为“书目疗法”（bibliotherapy）、“疗愈阅读”（healing reading）或“阅读疗法”（reading therapy）。在多种书目疗法类型中，发展性书目疗法是一种辅助心理治疗的自然疗愈方式。个人可以通过阅读适当的图书信息资源，使自身从沉郁不安的情绪转移到平和淡定的心理状态，进一步达到情绪疗愈（emotional healing）的效果，促使个人思考解决困扰的方式[9]。

 

表1 11例无牙颌患者口腔内均检测到的10个菌属Tab.1 10 genera detected in the oral cavity of11 edentulous subjects

  

菌门菌属克隆子数厚壁菌门链球菌属13980孪生菌属4678韦荣氏菌属1700颗粒链菌属1066变形菌门奈瑟菌属5660嗜血杆菌属3015假单胞菌属2793拟杆菌门卟啉单胞菌属2799普氏菌属1998放线菌门罗氏菌属4021合计10个41710

2.3 无牙颌患者口腔菌群的种水平分析

11例无牙颌患者口腔中均检测到的优势菌种有8个(表2)，共26 192 条序列，占总序列数的51.3%，包括：缓症链球菌(Streptococcus mitis)、毗邻颗粒链菌 (Granulicatella adiacens)、殊异韦荣菌 (Veillonella dispar)、香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)、副猪嗜血杆菌 (Haemophilus pittmaniae)、动物口腔奈瑟氏球菌 (Neisseria zoodegmatis)、卟啉单胞菌(Porphyromonas sp)、黏液罗氏菌 (Rothia mucilaginosa)。

1.2 主要表现 包括口腔的炎症性和溃疡性反应，或伴有口腔出血。多发生在化疗后7～14 d［9］。菌群种类与口腔pH值有关［10］:pH值升高时易出现细菌感染;pH值降低时易出现真菌感染，其致病菌多为革兰阴性菌和白念珠菌。溃疡可发生在舌尖部、舌边缘、两侧颊黏膜、上腭齿龈、口唇内侧、咽部等，常与药物种类有关，如长春新碱致口腔溃疡常位于上腭，盐酸柔红霉素和安吖啶注射液所致溃疡则分别在颊部和齿龈、咽部［11］。口腔出血常发生在黏膜及牙龈处，出血多呈血疱状。

 

表2 11例无牙颌患者口腔内均检测到的8个优势菌种Tab.2 8 dominant species detected in the oral cavity of11 edentulous subjects

  

门属种克隆子数厚壁菌门链球菌属缓症链球菌7783颗粒链菌属毗邻颗粒链菌1720韦荣氏菌属殊异韦荣菌986变形菌门假单胞菌属香茅醇假单胞菌3114嗜血杆菌属副猪嗜血杆菌2879奈瑟菌属动物口腔奈瑟氏球菌2087拟杆菌门卟啉单胞菌属卟啉单胞菌2331放线菌门罗氏菌属黏液罗氏菌5292合计8个8个26192

 

表3 11例无牙颌患者口腔内不同位点的优势菌种Tab.3 Dominant bacteria in different sites of the oral cavityof 11 edentulous subjects

  

排名口底/舌腹区舌背唇颊前庭硬腭/牙槽嵴顶唾液1缓症链球菌缓症链球菌缓症链球菌缓症链球菌缓症链球菌2黏液罗氏菌动物口腔奈瑟氏球菌溶血孪生球菌溶血孪生球菌黏液罗氏菌3香茅醇假单胞菌黏液罗氏菌香茅醇假单胞菌苛养颗粒链菌卟啉单胞菌4猫狗梭杆菌副猪嗜血杆菌苛养颗粒链菌副猪嗜血杆菌香茅醇假单胞菌5副猪嗜血杆菌毗邻颗粒链菌斯氏假单胞菌香茅醇假单胞菌毗邻颗粒链菌

2.4 基因文库的物种特征评估

对11例无牙颌患者口腔菌群构建的16S rRNA基因文库物种特征进行评估，结果见表4。覆盖率为99.1%，表明文库构建时每增加100个克隆子可获得1个不同物种，说明构建的16S rRNA基因文库能够代表口腔细菌物种；多样性指数为3.64，该数值越大提示菌落多样性较高，均匀度值为0.003 43，该数值越小提示菌群内物种数量分布越均匀，说明该基因文库的库容能够代表口腔环境中细菌群落的物种多样性。

 

表4 11例无牙颌患者口腔菌群基因文库的物种特征Tab.4 Species characteristics of oral flora gene librariesfrom 11 edentulous subjects

  

物种特征序列分析克隆子数51091种系型数239覆盖率99．1%多样性指数3．64均匀性指数0．00343

3 讨 论

以往口腔菌群研究主要针对天然牙的龋病、牙周病等口腔疾病[9，11-12]，而针对无牙颌患者的口腔菌群研究较少，且主要以分离培养法为主。由于口腔解剖结构的复杂性以及分离培养实验的局限性，该方面研究主要集中于单一口腔致病菌种，而对口腔正常菌群和致病菌群、常驻菌群和一过性细菌平衡以及动态变化关系的研究鲜有报道。采用分子生物学技术构建16S rRNA 基因文库并结合生物信息学软件分析口腔菌群，突破了以往分离培养法研究单一菌种的局限性。同时，快速、经济和高通量的焦磷酸测序使大批量基因测序成为可能，为全面分析无牙颌患者的口腔菌群组成提供了有力的技术支持。

本研究采用焦磷酸测序技术分析了11例无牙颌患者口腔菌群共51 091条16S rRNA基因序列，依据16S rRNA基因序列同源性高于97%(cut-off值为3%)，即选取3%的差异划分OTU[13-14]，共获得239个OTUs。其中，135个OTUs是可培养的标准菌种，占总数的56.5%，而其余43.5%的菌种均难以培养，证实了口腔细菌中未培养菌种和未知菌种的复杂程度远远超出目前的认识范围。该结果与以往研究以及我们前期对健康人群的研究报道相一致[9，15]。然而，目前OTU的划分界限仍没有标准化，不同研究划分标准不同，允许的序列差异从1%至5%各不相同，这就给不同文库之间的统计比较带来很大困难。有学者认为3%的cut-off 值会低估实际的物种数量，亦有研究采用1%的cut-off 值划分OTU来估计中度龋、快速进展龋患者口腔中的菌种特点，有学者提出用焦磷酸测序法对健康人唾液和龈上菌斑中的菌种对比分析，如采用3%和6%的cut-off 值划分OTU，分析所得物种特点存在差异[16-18]。

本研究发现定植于口底/舌腹、舌背、唇颊前庭、硬腭/牙槽嵴顶、唾液中的优势菌种存在差异，这可能与口腔内不同位点的氧张力、pH值、清洁频率存在差异有关[19]。11例无牙颌患者口腔中均检测到的菌种为缓症链球菌、毗邻颗粒链菌、殊异韦荣菌、香茅醇假单胞菌、副猪嗜血杆菌、动物口腔奈瑟氏球菌、卟啉单胞菌、黏液罗氏菌，共26 192条序列(占总序列的51.3%)。推测这8种细菌是无牙颌患者口腔中的优势菌种，影响着口腔健康和疾病状态下的微生态环境。口腔优势菌种是竞争且互惠共生的生物关键种，对各类生态过程有重要影响，并对维持口腔环境的健康平衡起关键作用。我们以往关于健康人口腔优势菌种的研究结果显示，占口腔中42%的菌种为缓症链球菌、韦荣氏球菌、殊异韦荣菌、梭杆菌、奈瑟氏菌、副流感嗜血菌、惰性聚集放线杆菌、杆状链球菌、链球菌、毗邻颗粒链菌[9]。与健康人数据相比，本研究中的11例无牙颌患者口腔菌群在菌种水平发生较大变化，表明口腔菌群的菌种数量和组成在全部牙齿缺失后会发生改变，这种改变与口腔疾病之间存在何种关联需要进一步深入研究。

在消化道疾病中胃溃疡较为常见,临床初步认为与长期服用药物、应激精神因素和遗传存在相关性,若患者的病情较为严重会提升并发症发生率,如:上消化道出血和休克,在一定程度上对其身心健康构成威胁。临床既往的治疗手段以四联疗法为主,但是难以达到理想的治疗效果[1]。为此,此研究选择我院近一年(2016年3月至2017年3月)收治的胃溃疡患者76例,对其实施消化内镜联合四联疗法的价值进行探究。

本研究中与龋病密切相关的变异链球菌和远缘链球菌在11例无牙颌患者口腔中均未检出。与牙周病相关的可疑致病菌中，伴放线放线杆菌、福赛斯坦纳菌、中间普氏菌、变黑普氏菌、直肠弯曲菌未检出，但在个别无牙颌患者口腔中检测到牙龈卟啉单胞菌、有害月单胞菌、产黑普氏菌、具核梭杆菌和齿垢密螺旋体。以往观点认为，牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌会随着牙齿的全部丧失而失去定植场所，不再生长于口腔环境中[20]。而本研究中部分牙周致病菌的检出突破了该观点。这些牙周致病菌亦与冠心病、脑梗塞、糖尿病、细菌性心内膜炎等系统性疾病存在一定联系[21-23]。此外，本研究在舌背检测到肺炎链球菌，故老年无牙颌患者有通过咳嗽吸入肺炎链球菌而诱发肺炎的风险。因此，全面了解老年无牙颌患者的口腔菌群特点有助于预防一些系统性疾病的发生，有利于改善老年人的健康状况。

[参 考 文 献]

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