不同筛选标记法构建白念珠菌RAS1基因敲除株的比较

自20世纪80年代末以来，基因敲除已成为一种迅速发展的新型分子生物学技术。基因敲除是指通过一定的途径使特定的基因沉默或缺失的技术，使其相应的基因功能丧失。基因敲除的目的是探讨序列已知但功能未知的基因功能，进而实现生物体特定功能的改变。同源重组是一种常用的基因敲除技术[1]，该技术通过将构建的载体DNA转染至靶细胞内，载体中同源臂DNA序列会自动识别靶细胞内染色体上同源DNA序列，随后置换该靶细胞染色体上同源DNA序列之间的目标基因，从而达到敲除目标基因的目的[2]。

白念珠菌是临床上最常见的机会性致病菌[3]，其可寄存于患者留置的导管或者其他医疗设备而引起免疫力低下病人的播散性感染[4]，过度和长期使用抗真菌药物使白念珠菌对当前很多抗真菌药物产生耐药性[5-7]。白念珠菌致病及耐药相关的机制研究需要采取基因敲除这一分子生物学技术。白念珠菌基因敲除方法有同源重组技术和RNA干扰技术等。前者是白念珠菌基因敲除经典方法，技术成熟稳定，目前仍是基因敲除的主要方法。后者是近年来的新进技术[8]，由于白念珠菌中的RNA干扰机制尚不明确，基于RNA水平对基因功能展开研究的报道较少，尚未得到广泛应用。

三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白RAS1是白念珠菌细胞内具有高度保真的一种小型GTP酶，有RAS-GTP的活性状态和RAS-GDP的失活状态两种存在形式[9]。当其处于活化状态时，可使下游的效应分子活化[10]。RAS1主要通过细胞内cAMP水平来调控细胞的各种代谢活动，包括形态转换、细胞壁膜结构与组成、应激反应、粘附入侵等[11-14]。在白念珠菌RAS1/MAPK和RAS1/cAMP/PKA信号通路调控研究中需要构建RAS1基因敲除株，以便于深入探讨RAS1在上述病理生理过程中的生物学功能。本研究对白念珠菌RAS1基因进行了敲除实验，比较了2种不同筛选标记的基因敲除方法：一个是Nobel等提出的以HIS1-LEU2-ARG4为筛选标记的基因敲除策略[15]；另一个是以URA3为筛选标记的URA-Blaster法敲除RAS1两条等位基因的方案[16-19]。本研究有助于研究者在白念珠菌的生理、病理、以及耐药分子机制研究中选择合适的基因敲除方案。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

白念珠菌SN152、CAI4亲本菌均为SC5314。其中，念珠菌SN152为精氨酸(ARG)、组氨酸(HIS)、和亮氨酸(LEU)缺陷菌株，基因型为arg4/arg4 leu2/leu2 his1/his1 URA3/ura3::imm434；质粒pSN52、pSN40均由第二军医大学新药研究中心实验室馈赠，分别带有C.d.HIS1和C.m.LEU2筛选标记。而念珠菌CAI4为URA3缺陷株，基因型为ura3Δ::imm434/ura3Δ::imm434；质粒p5921购自北京泛基诺有限公司，带有hisG-URA3-hisG基因敲除盒及氨苄青霉素抗性标记。

住院患者服务中心由8人组成，其中3人为心理学专业。部门开展患者心理教育，服务对象覆盖从婴儿到80岁老人的全人群。刚刚降临人世的孩子需要人文关怀吗？很多人摇头，但每个孩子分明都是哲学家，他们的心理与成人不同，但不代表没有心理。

1.2 主要试剂和仪器

SD-HIS、SD-LEU、SD-HIS-LEU、SD-URA选择培养基(北京范基诺科技有限公司)， Ex Taq酶(TaKaRa，日本)，质粒DNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek，美国)，酵母转染试剂盒(Clontech，美国)，基因组DNA提取剂盒(ZYMO，美国)，BamHⅠ、SacⅠ、KpnⅠ限制性内切酶(TaKaRa，日本), PCR仪(Eppendorf,德国)。

东营凹陷位于山东省东北部，勘探面积约5 850km2，是济阳坳陷油气资源最丰富的凹陷［1］。“九五”以来，东营凹陷进入以岩性油藏为主的隐蔽油气藏勘探阶段，至今上报岩性油藏探明储量近亿吨［2］。经过10余年的勘探开发，以东营凹陷中带为代表的岩性油藏发育区已进入较高勘探阶段，勘探对象向个体规模较小、埋深大、更复杂的岩性体转变。但是，少数探井难以探明和动用区块储量，勘探成果点多面少，难以实现规模效益，区块勘探周期过长，难以迅速转化为开发效益。为进一步提高岩性油藏勘探效益，降低开发风险，实现规模效益新突破，笔者提出岩性油藏精细勘探的设想。

1.3 引物

所有引物均由Primer Premier 5软件进行设计并在NCBI BLAST网站检测其特异性。由上海捷瑞生物工程有限公司合成。其中，Universal F的5'端ccgctgctaggcgcgccgtg序列与引物 UP R的5'端cacggcgcgcctagcagcgg序列反向互补；Universal R的5'端gcagggatgcggccgctgac序列与DOWN F的5'端gtcagcggccgcatccctgc序列反向互补。在RAS1a-F/R和RAS1a-F、RAS1b-F/R和RAS1b-F 5'端加入线性化克隆载体末端的同源序列，使得扩增产物5'和3'最末端序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致(表1)。

 

表1 引物序列Tab.1 Primer Sequences

  

引物序列UniversalFccgctgctaggcgcgccgtgAGCTCGGATCCACTAGTAACGUniversalRgcagggatgcggccgctgacGCCAGTGTGATGGATATCTGCRAS1-FGATGAATATGACCCAACTRAS1-RAAGAAACACCTCCATTACUP⁃FCTCCCTAACCCCAGTAAAUP⁃RcacggcgcgcctagcagcggTCAAGGTCAATGTCCAATDOWN⁃FgtcagcggccgcatccctgcTGATTGTTTCCAAGTTACDOWN⁃RAAGGTATGAAGAGGATGTUpcheckATGACAATCCCTCCCTAAHISleftTGCATAAACGGTGGCACATTLEUleftAAACCTCTTTCTTGACCCHISrightTCCAATTCAACGACGGCTGALEUrightGATTCTGATTGGCTCTTTDowncheckGAGACAAAGGTATGAAGAGGRAS1a⁃FGAGCTCGGTACCACAATCCCTCCCTAACCCCARAS1a⁃RTGCACCACTGGAAGATCTATGGTATG⁃TATATGTGTGGATATGAATRAS1b⁃FGGATCCGAGTCAAAGATTCTGATAATGTTCCARAS1b⁃RAAGCTTCATTTTGATCTATTATTCCAT⁃CACTACTTACACCACCATURA⁃FATCTCGTCTGTTTTCCTTCURA⁃RCATGAGTTTCTGCTCTCTCAC

1.4 菌株的培养和鉴定

SN152菌株经Magar念珠菌显色培养基(CHRO公司)、SD-HIS、SD-LEU、SD-HIS-LEU选择培养基鉴定；CAI4菌株经Magar念珠菌显色培养基、SD-URA选择培养基鉴定。随后，2个菌株均由YPD培养基及培养液培养。

1.5 白念珠菌基因组DNA抽提

URA-Blaster法：将质粒线性化产物用醋酸转染法转染入CAI4菌株中(图2)。在SC-URA选择培养基上30 ℃倒置培养48 h。得到的转化子在5-氟乳清酸(5-FOA)平板上复筛[20]。菌落PCR鉴定出阳性转化子。再次重复以上操作以得到RAS1双等位基因敲除株。亲本菌及所得的阳性转化子均涂在YPD及选择培养基上进行营养筛选鉴定。

1.6 质粒转化与抽提

采用氯化钙法将质粒(pSN52、pSN40、p5921)转化至制备好的感受态大肠杆菌 DH5α内，取转化菌液涂布至含抗生素固体培养基上，30 ℃孵育过夜至长出阳性单克隆。挑取单克隆菌落至LB培养液中，200 r/min, 30 ℃过夜培养。按照说明书用质粒DNA中量抽提试剂盒抽提。

1.7 基因敲除组件构建及鉴定

1.7.2 质粒线性化产物(URA-Blaster法)的构建及鉴定 以白念珠菌CAI4基因组DNA为模板，以RAS1a-F、RAS1a-R为引物扩增上游同源臂片段(RAS1a)，此片段包含BamHⅠ、HindⅢ 酶切位点。以RAS1b-F、RAS1b-R为引物扩增下游同源臂片段(RAS1b)，此片段含有SacⅠ、BglⅡ 酶切位点。取1 μg质粒p5921，用BamHⅠ/SacⅠ限制性内切酶酶切3 h[19-20]。酶切体系:载体1 μg，green Buffer 3 μL，内切酶3 μL，ddH2O补充到30 μL。将载体与上下游片段进行连接，37 ℃连接30 min。连接体系：载体50～200 ng，同源臂片段50～200 ng，5×CE Buffer 4 μL，Exnase 2 μL，ddH2O补充到20 μL。将连接后的质粒转化入大肠杆菌中，涂LB平板，挑选阳性克隆子进行测序。得到的质粒用KpnⅠ限制性内切酶进行线性化处理。线性化产物用PCR产物回收试剂盒回收后备用。

1.7.1 融合基因片段(HIS-LEU-ARG基因敲除策略)的构建及鉴定 以白念珠菌SN152基因组DNA为模板，以UP-F、UP-R为引物扩增上游同源臂片段(UP)，以DOWN-F、DOWN-R为引物扩增下游同源臂片段(DOWN)(图1)。以质粒pSN52和质粒pSN40为模板，Universal F、Universal R为引物扩增HIS1、LEU2片段[15](图1)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。以纯化后PCR产物UP、HIS1、DOWN为模板，以UP-F、DOWN-R为引物扩增融合片段(UP-HIS1-DOWN)[15]。以同样的方式扩增出融合片段(UP-LEU2-DOWN)(图1)。反应体系为：5 μL 10×缓冲液，4 μL dNTP, 50 ng上下游片段，200 ng筛选标记(HIS1/LEU2)，0.5 μL EX Taq酶，1 μL UP-F，1 μL DOWN-R，ddH2O补充到50 μL。反应条件为：96 ℃预变性，94 ℃ 30 s, 55℃ 50 s,72 ℃ 3 min,共35个循环，72 ℃ 10 min延伸。产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用PCR产物回收试剂盒回收后备用。

经鉴定SN152、CAI4为白念珠菌，在YPD固体培养基上能够生长。SN152在SC-HIS、SC-LEU、SC-HIS-LEU选择培养基上均不能生长；CAI4在SC-URA选择培养基上不能生长。说明2种亲本菌均符合规定的实验要求。

  

图1 HIS-LEU-ARG基因敲除策略敲除RAS1基因Fig.1 HIS-LEU-ARG knocking-out strategy for knocking-out RAS1 gene

1.8 RAS1基因敲除株的构建及鉴定

以白念珠菌SN152基因组DNA为模板的融合基因片段的鉴定结果：RAS1基因上游同源臂(Up)长度为428 bp，下游同源臂(Down)长度为344 bp(图3)。扩增出的LEU2标记长度为2 307 bp，HIS1标记长度为2 388 bp(图4)。RAS1第一拷贝等位基因的敲除片段(UP-HIS1-DOWN)通过融合PCR合成。以UP-F、DOWN-R为引物，进行融合PCR反应，扩增产物长度为3 120 bp(图4)。以同样的原理制备RAS1第二拷贝等位融合基因片段(UP-LEU2-DOWN)，产物长度为3 039 bp(图4)。

采用酵母基因组DNA提取试剂盒的方法，将SN152、CAI4单克隆菌株培养过夜，离心收集菌株，无菌水洗涤1次，加入120 μL YD Digestion Buffer和5 μL R-Zymolyase，混匀，37 ℃水浴1 h。加入120 μL YD lysis Buffer和250 μL氯仿混匀。离心收集上清液，DNA Wash Buffer洗涤2次，50 μL无菌水洗脱DNA。-20 ℃保存备用。

  

图2 URA-Blaster法敲除RAS1基因敲除示意图Fig.2 The strategy for knocking-out RAS1gene by URA-Blaster

2 结 果

2.1 亲本菌SN152、CAI4菌株鉴定结果

[8] W.J.T 米歇尔《图像学：形象、文本、意识形态》[M]，北京：北京大学出版社，2012年，P50.

本次学术论坛汇集了成人教育、职业教育领域研究的专家学者、期刊代表以及博士。他们基于新时代背景，对中国成人与继续教育事业进行探讨，并呈现出一定的研究取向。

2.2 融合基因片段的鉴定结果

HIS-LEU-ARG法：将融合基因片段(UP-HIS1-DOWN)用醋酸锂转染法转染入SN152菌株中(图1)，在SC-HIS选择培养基上30 ℃倒置培养48 h。挑选单克隆，菌落PCR鉴定出阳性转化子RAS1+/-。用同种办法将融合基因片段(UP-LEU2-DOWN)转染至鉴定正确的RAS1+/-菌株中，于SC-HIS-LEU选择培养基上30 ℃倒置培养48 h至长出单克隆菌落。菌落PCR鉴定出阳性转化子RAS1-/-。亲本菌及所得的阳性转化子均涂在YPD及选择培养基上进行营养筛选鉴定。

2007年无锡供水危机后，国家下决心进一步治理太湖，2008年出台了《太湖流域水环境综合治理总体方案》，以减污治污为中心，以节水调水为手段，工程措施与社会管理相结合，对太湖流域进行综合治理和管理。《条例》明确太湖流域管理应当遵循全面规划、统筹兼顾、保护优先、兴利除害、综合治理、科学发展的原则，并赋予了太湖局统筹协调、监督和管理职责。

中国虽然已成为世界上第二大经济体，但在金融业发展水平上未能进入世界第一效率阵营，在金融服务及金融监管上仍需要向世界先进水平看齐。

2.3 质粒线性化产物的鉴定结果

以白念珠菌CAI4基因组DNA为模板的质粒线性化产物的鉴定结果：通过无缝克隆组装，构建了RAS1基因敲除质粒，测序结果表示构建成功。用KpnⅠ限制性内切酶酶切基因敲除质粒，鉴定质粒线性化成功(图5)。

  

Marker：DL1000；Up：RAS1上游同源臂；Down：RAS1下游同源臂Marker：DL1000 DNA marker； Up：upstream homologous arm of RAS1；Down：downstream homologous arm of RAS1

 

图3 RAS1上下游片段的鉴定Fig.3 Identification of the RAS1 upstream anddownstream fragment

  

M1为1 kb DNA标记；M2为DL5000；A为LEU2标记；B为HIS1标记；C为 UP-LEU-DOWN片段；D为 UP-HIS-DOWN片段M1：1 kb DNA marker； M2：DL5000； A：LEU2 marker；B：HIS1 marker；C：UP-LEU-DOWN fragment； D：UP-HIS-DOWN fragment

 

图4 融合PCR产物的鉴定Fig.4 Identification of the fusion reaction products

2.4 RAS1基因敲除株的鉴定结果

鉴定第一拷贝敲除株用引物Up check，Down check验证。亲本菌SN152在1 624 bp处有单条带，包含RAS1全长ORF及所选上下游同源臂序列的整个片段。第一拷贝敲除株在1 624 bp和3 137 bp处有两个条带，说明RAS1等位基因一条被敲除片段(UP-HIS1-DOWN)所代替，一条为原基因序列(图6)。鉴定双拷贝敲除株用引物Up check，HIS left；HIS right，Down check扩增敲除片段同源重组后HIS1上下游片段，用引物Up check，LEU left；LEU right，Down check扩增LUE2上下游片段，用RAS1-F，RAS1-R扩增RAS1基因。HIS1上下游片段长度分别为791、428 bp，说明HIS1上下游连接正确。LEU2上下游片段长度分别为572、420 bp，说明LEU2上下游连接正确。而RAS1-F，RAS1-R 未能成功扩增出条带，说明RAS1基因已被替代，双拷贝敲除成功(图6)。用质粒线性化产物转染白念珠菌CAI4，所得转化子用引物URA-F，URA-R扩增替换目的基因的hisG-URA3-hisG片段，均未在1 980 bp处出现条带(图7)，说明未能成功替换RAS1基因。

  

M：DL10000；A：质粒线性化产物；B：RAS1基因敲除质粒M:DL10000 DNA marker； A:plasmid linearization product；B: RAS1 knockout plasmid

 

图5 KpnⅠ单酶切后线性化质粒鉴定结果Fig.5 The gel map of plasmids digested by KpnⅠ

  

M1：1 kb DNA标记；A：亲本菌SN125；B：RAS1+/-； M2：DL5000；1：RAS1基因；2：HIS1上游片段；3：HIS1下游片段；4：LEU2上游片段，5：LEU2下游片段M1：1 kb DNA marker；A：SN152 strain；B：RAS1+/-；M2：DL5000 DNA marker；1：RAS1 gene；2：HIS1 upstream fragment；3：HIS1 downstream fragment；4：LEU2 upstream fragment；5：LEU2 downstream fragment

 

图6 RAS1基因敲除株的鉴定Fig.6 Identification of RAS1 gene knockout strains

  

M：DL5000, 数字表示转化子M：DL5000 DNA marker, the number representing colonies

 

图7 转化子假阳性结果Fig.7 False positive results of colonies

2.5 RAS1基因敲除株营养型鉴定

对于采用HIS-LEU-ARG基因敲除策略：所得到的阳性转化子进行营养型鉴定发现，第一拷贝敲除株RAS1+/-可在YPD培养基和SC-HIS培养基上生长，而不能在SC-LEU培养基上生长。双拷贝敲除株RAS1-/-可在YPD、SC-HIS、SC-LEU、SC-HIS-LEU培养基上生长(图8)。采用URA-Blaster法：未能得到RAS1基因敲除株，故无营养型鉴定结果。

3 讨 论

HIS-LEU-ARG基因敲除策略中以HIS1、LEU2及ARG4基因缺陷株SN152为亲本菌，其筛选标记LEU2为麦芽糖念珠菌来源，HIS1、ARG4为都柏林念珠菌来源[15]。采用异源性筛选标记既可补充亲本菌SN152的营养缺陷，同时又可提高筛选效率。此外，三种筛选标记两两组合来构建白念珠菌基因敲除株，结果表明3种组合的同一基因敲除株表型一致[15]。目前，还没有发现LEU2、HIS1和ARG4基因的异位表达会对白念珠菌的表型产生影响。URA-Blaster法是最早的白念珠菌营养筛选基因敲除策略[16]。此策略中构建的亲本菌CAI4为URA3基因缺陷株。CAI4菌株中，URA3基因缺失的同时导致相邻的IRO1基因3′端缺失，与亲代菌SC5314 相比，CAI4 菌株中的14种蛋白都有表达缺陷[21]，对后期构建的基因敲除株可能产生一定的影响。此外，有学者根据小鼠实验结果得出，至少有50个基因被认为是白念珠菌潜在的毒力因子，而经URA-Blaster法敲除后突变体的毒性作用小于其对应的野生株[22]。而且，在含有5-FOA的培养基上筛选阳性克隆子时，URA3缺失的菌株生长缓慢。即使URA3回复原来位置后，仍会影响菌株的毒力、形态转换和黏附等[21，23]。从上述信息可以看出，采用HIS-LEU-ARG基因敲除策略所得到的基因敲除株的生物学特性要优于URA-Blaster法。

  

上方为亲本菌SN152，左下为RAS1+/-, 右下为RAS1-/-SN152 strain at the top of medium,RAS1+/-at the lower left, RAS1-/-at the lower right

 

图8 菌株的营养型鉴定Fig.8 Identification of nutritional type in strains

HIS-LEU-ARG基因敲除策略的操作效率要高于URA-Blaster法。首先，前者通过两轮PCR将目的基因上下游同源臂与筛选标记整合，即可构建用于基因敲除的融合片段。其融合PCR的产物回收可用PCR产物回收试剂盒回收。操作简单且效率高。而后者通过两轮无缝克隆将目的基因上下游同源臂整合在hisG-URA3-hisG基因敲除盒的两端，构建出用于基因敲除的质粒。无缝克隆涉及目的基因扩增、载体和目的基因酶切、感受态细胞转化和阳性克隆的筛选，每一步都要恰好才能得到目标产物。无缝克隆产物需要切胶回收产物，紫外线的照射和EB均对DNA片段产生损伤。因此，实验结果的假阳性增高。其次，HIS-LEU-ARG基因敲除策略在2次同源重组时使用2种不同的筛选标记置换目的基因，提高了第2次同源重组效率。而URA-Blaster法2次同源重组均使用相同的筛选标记。此外，URA-Blaster法在含有5-FOA 的培养基上筛选阳性克隆子时，容易造成子代敲除株染色体重排[23]，而HIS-LEU-ARG基因敲除策略无需5-FOA复筛选阳性克隆子这一步骤。

在白念珠菌转染过程中，本研究采用的2种基因敲除方法主要包括了转染和同源重组2个步骤。采用HIS-LEU-ARG基因敲除策略是通过融合PCR构建的片段达到转染目的，而URA-Blaster法是采用质粒线性化产物而达到转染目的。前者为线性短DNA片段，转染效率高。后者用于基因敲除的质粒在转染之前需要将环状的质粒酶切成线性，KpnⅠ内切酶酶切形成粘性末端，极可能发生自连或酶切不完全，导致转染效率降低；且质粒线性化产物长度比融合基因片段长约4 kb碱基对，也可能导致转染效率低下。基因的同源重组效率主要依赖于基因敲除组件提供的同源区域片段大小[24-25]，本研究中采用的这两种方法都使用了300～500 bp的上下游同源序列，因此，在同源重组这一步骤中，推测2种方法的效率并无明显差异。

成功构建RAS1基因敲除株，为进一步研究RAS1基因与白念珠菌耐药性之间的关系奠定了基础。本研究进行了HIS-LEU-ARG基因敲除策略和URA-Blaster法敲除白念珠菌RAS1基因效率的比较，发现前者操作步骤简化，基因敲除效率提高。此外，有学者通过CRISPR-Cas9技术构建白念珠菌基因敲除株报道，该技术无需与白念珠菌基因组整合[26]，但此技术存在脱靶效应，并未广泛应用。

[参 考 文 献]

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