白念珠菌口腔黏膜感染小鼠模型的建立及评估
白念珠菌(Candida albicans, C. albicans)是人类口腔、胃肠道和泌尿生殖道常驻条件致病真菌,与口腔念珠菌病相关,其致病通常与个体局部或全身系统性因素有关。义齿的使用[1]、糖尿病[2]、年龄增高所致的唾液功能减退[3]、广谱抗生素的广泛应用[4]、免疫抑制剂长期使用、免疫功能缺陷[5-8] 等都会诱发念珠菌感染。近年来,白念珠菌感染在免疫功能低下或患有人类免疫缺陷病毒的患者中存在增高趋势。构建一种简便、稳定的动物念珠菌感染模型有助于深入了解念珠菌致病的机制,研究口腔念珠菌感染过程中宿主与白念珠菌之间的相互作用,进而探索新的抗真菌感染药物以及治疗新方法[9]。
目前小鼠念珠菌感染模型种类日益增多,但口腔黏膜感染模型建模较困难,原因是口腔感染具有自限性,正常小鼠白念珠菌口腔感染会被机体免疫清除[10]。本实验采用泼尼松龙等糖皮质激素使小鼠处于免疫功能低下状态,在此基础上构建口腔黏膜念珠菌感染模型、评价口腔内黏膜及全身的感染情况,深入探讨小鼠口腔白念珠菌感染的变化特点,为动物实验选择合适的研究模型提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 实验动物
50只SPF级ICR小鼠,雌性,6周龄,体质量20~25 g,购于南京医科大学医药实验动物中心,随机分为实验组与空白组,各25只适应性饲养1周。本动物实验已通过南京医科大学动物实验伦理审查同意。
1.2 白念珠菌悬液制备
白念珠菌标准株SC5314,从美国模式培养物集存库(ATCC)购置。将-70 ℃保种的白念珠菌标准株置SDA培养基上生长,37 ℃ 5% CO2培养24 h。取单克隆菌株接种于YPD培养液中,30 ℃,180 r/min,摇床过夜。将YPD培养液中的菌液3 000 r/min离心5 min,无菌PBS洗涤2次,血细胞计数法计数,并用生理盐水制备成浓度为2×108个/mL的菌悬液。
1.3 小鼠白念珠菌感染口腔模型构建
口腔念珠菌病动物实验模型构建方法参考文献[11-12]。在接种前1 d和接种后第3天小鼠肌肉注射10 g/L泼尼松龙促使小鼠免疫抑制,同时前1 d饮水中加入盐酸四环素0.83 g/L直至实验结束。接种前小鼠大腿肌肉注射50 μL 2 g/L氯丙嗪麻醉,使其镇静状态持续约3 h。棉拭子浸入2.0×108个/mL的白念珠菌悬液,涂抹接种小鼠整个口腔(包括颊黏膜、舌、软腭以及口腔其他黏膜表面)1 min;空白组同样进行泼尼松龙及四环素处理,以灭菌生理盐水涂抹口腔。
1.4 感染程度评估
小鼠感染1 d后出现松毛和行动迟缓的现象,3~5 d出现震颤、蜷缩、眼睑闭合等情况,7 d时松毛现象有所缓解。无小鼠死亡。图3A示小鼠体重整体呈现逐渐下降趋势,其中1~3 d内小鼠体重下降明显(体重丧失比重11%),3~7 d内持续下降,但之后下降减缓,到接种7 d时小鼠体重下降约25%。
1.4.4 组织载菌量测定 小鼠下降结肠收取粪便,同时无菌解剖肾、肝,称重后分别放入含1 mL生理盐水的组织研磨器中研磨,无菌PBS 10倍稀释,分3份涂布沙堡氯霉素培养基中,37 ℃下培养 24 h,计数培养基上生长的菌落并取10的对数,单位CFU/g。
1.4.3 口腔白念珠菌菌量评估 以菌落形成单位(CFU)表示。无菌棉拭子擦拭小鼠整个口腔(包括颊黏膜、舌头、软腭和其他口腔黏膜表面)。棉签头部剪掉立即放入含有0.99 mL PBS的离心管内,旋涡振荡器震荡1 min,进行连续10倍梯度稀释,在每个稀释液取0.1 mL接种到沙堡氯霉素培养基中,每个浓度分3个平行板,37 ℃下培养 24 h,计数培养基上生长的菌落CFU并取10的对数,单位CFU/mL。
假膜型白念珠菌感染动物模型是一种用于口腔念珠菌感染研究的动物模型。由于该小鼠模型具有口腔伪膜等局部临床体征,模拟了人体伪膜型白念口腔感染。白念珠菌在口腔黏膜感染分为假膜型、红斑型和增殖型。最后一种形式是慢性的,而前两种则为急性病损。本研究的动物模型是假膜型念珠菌病,其特点是在颊黏膜、舌头和软腭表面的白色伪膜,临床上常见于局部或全身皮质类固醇的患者、人类免疫缺陷病毒阳性患者和其他类型的免疫缺陷的患者[13]。本研究选用ICR小鼠作为动物模型,因为该品系小鼠在国内外大多数动物实验中广泛使用,同时易于操作和接种,价格便宜。本研究选用SC5314 株作为模型建立的菌株,考虑到该株为标准株,应用广泛,同时可以用于大多数的基因突变研究,以其为亲本构建突变株,来评估毒性表型[14-15]。结合国内外文献和前期实验,伦理学对动物的保护,我们选择了接种1周内作为观察时间。
1.4.2 口腔舌背病损观察及评估 在接种后1、3、5、7 d随机选取5只小鼠,脱颈处死后观察小鼠舌头,对小鼠舌背表面伪膜面积及厚薄进行评分。评分标准如下:0分:正常;1分:少量薄伪膜,覆盖舌表面<20%;2分:薄伪膜, 覆盖舌表面积≤90%且>21%;3分:薄伪膜,覆盖舌表面积>91%;4分:厚伪膜,覆盖舌表面积>91%。
小鼠的粪便载菌量结果参见图3B。感染后的粪便载菌量逐日上升,第5天达到最高,接近107CFU/g,第7天有所下降。与之相反,小鼠肾、肝内组织载菌量为0(未显示),载菌量在7 d中并无变化。
1.5 数据处理
他汀类药物对经皮冠状动脉介入治疗患者术后短期肾功能及炎性指标的影响………………………… 李新峰 张领 蔡华 等(1)78
实验结束后,小鼠舌背病损评分、口腔白念珠菌菌量、体重、组织载菌量等数据结果以表示。采用GraphPad Prim 5进行数据分析和图表形成。
中国高铁要走出国门,合作国目前的政治社会环境也是一个不可忽视的因素,复杂的地域政治因素同样会造成影响。例如我国在2015年印度高铁项目竞标中取得了胜利,然而同一年安倍出访印度,莫迪总统在12月13日选择了让日本修筑印度高铁,虽然日本提出的方案中贷款政策相较我国更加优惠,但其中也掺杂着政治因素。
2 结 果
2.1 感染小鼠口腔局部状况变化
图1和图2A结果显示小鼠接种白念珠菌1 d后舌背病损及评分((0.9±0.15)分,主要为0分和1分)未见明显变化,1~2 d内伪膜迅速出现并增长,3~5 d舌背可见厚的伪膜,覆盖面积超过舌表面的90%((3.4±0.18)分,(3.6±0.21)分,病损评分主要为3分和4分),7 d时舌背仍有伪膜存在,但覆盖面积不足90%((2.8±0.20)分,病损评分多集中在2分和3分)。
图2B可以看到口腔白念菌量从接种1 d后(5.32±0.27)CFU/mL开始增长,到5 d时达到最高值(6.78±0.21)CFU/mL,7 d时稍有所下降(6.32±0.34)CFU/mL,但3~7 d内白念珠菌菌量趋于稳定于106~107 CFU/mL。
图1 白念珠菌感染小鼠舌背病损变化情况Fig.1 Changes of white patches of murine tongues lesions after C. albicans oral infection
A:感染小鼠舌背病损评分变化;B:小鼠感染后口腔白念珠菌菌量变化A:changes of score of C. albicans-inoculated tongues lesion;B:changes of the numbers of viable C. albicans cells in the oral cavity after C. albicans oral infection
图2 小鼠感染后口腔黏膜局部变化情况Fig.2 Oral mucosal changes of mice after infection
2.2 感染小鼠系统体征状况变化
1.4.1 一般状况 接种后观察并记录小鼠皮毛、行为、黏膜、眼睛、体重和死亡情况等表现。
基于通信的列车控制(communication based train control,CBTC)系统是轨道交通的主流技术[1],目前CBTC开始使用工作在1.8 GHz的LTE-M(long term evolution-metro)技术.多输入多输出(multiple-input multiple-output,MIMO)作为LTE-M的关键技术,在不增加带宽的情况下能有效提升系统容量.因此,研究隧道环境下MIMO无线信道特性对于系统设计和优化至关重要.
1.4.5 病理学分析 取小鼠舌头固定于4%的多聚甲醛中,脱水包埋,切取5 μm厚度的组织,进行PAS染色,用光学显微镜(200倍放大)观察白念珠菌感染情况和组织损伤程度。
A:小鼠体重丧失比重变化曲线;B:感染小鼠粪便载菌量变化曲线;A:ratio of bodyweight loss in C. albicans infected mice;B:changes of C. albicans cells recovered from feces of infected mice
图3 口腔黏膜感染小鼠系统变化Fig.3 System changes of oral mucosal infection mice
2.3 口腔黏膜感染小鼠的组织病理学分析
PAS染色显示空白对照组小鼠舌背可见丝状乳头整齐排列,未见明显白念珠菌。接种后第1天小鼠舌背病理学切片可见白念珠菌形成菌丝,多位于舌乳头表面之间。第3天小鼠舌背菌丝增多,舌乳头及周围的上皮细胞层破坏,菌丝下方上皮可见炎症细胞浸润。第5天可见较厚的菌丝团覆盖,菌丝较长并侵入上皮组织,同时上皮结构破坏更严重。第7天舌表面菌丝较第5天少,多为酵母细胞,同时舌乳头丧失,黏膜上皮开始修复。参见图4。
A~D:依次为接种后1、3、5、7 d;E:空白组小鼠A~D: murine tongues,PAS staining at 1 d,3 d,5 d and 7 d after infection; E the blank group
图4 白念感染小鼠舌背纵切片显微图片(PAS ×200)Fig.4 Microscopic image in longitudinal section of dorsal surface of the C. albicans-infected tongues (PAS ×200)
4 讨 论
三是得益于试点示范先行。为了探索山洪灾害防治的有效途径和方法,国家防办在全国组织103个县开展山洪灾害防治非工程措施试点。试点建设取得了良好效果,在近年山洪灾害防御中发挥了显著作用。通过总结试点经验,探索了符合我国国情的山洪灾害防治建设模式,建立了山洪灾害防治技术标准体系,培养了大批项目管理人才,为项目建设顺利实施奠定了坚实的基础。
Takakura等[11]选择皮下注射泼尼松龙建立模型,而本研究选择泼尼松龙肌注促使免疫下降,相较于皮下注射,肌肉注射发生作用更迅速,本研究在接种第2天即出现较高的菌量和舌背明显的伪膜(结果未显示),这要早于Takakura的研究结果。而且相比较于Takakura报道的结果,本研究中建模后的菌量要更高,舌背伪膜情况更严重,也更明显,其原因可能是选用的菌种、菌液浓度不同,不同菌种对ICR小鼠口腔黏膜粘附定植能力不一样。而Okada等[16]研究小鼠模型早期白念珠菌感染,发现接种白念珠菌48 h后小鼠感染情况最重,可能是因为Okada选用的是临床黏膜感染分离的菌株,毒力更强。罗银珠等[17]采用带菌(7×106个/mL)棉签置于小鼠口腔并停留1.5 h的口腔黏膜接种方式,以建立小鼠机会性系统性感染模型,而本研究通过带菌(2×108个/mL)棉拭子擦拭口腔1 min来接种,由于菌液量、菌液浓度和带菌棉签停留口腔时间的差异,构建的感染模型也存在差异。此外,有文献使用手术刀片划伤或用探针轻划舌背[18]来建立口腔黏膜感染模型,考虑到此法对小鼠口腔黏膜创伤较大,故本实验采用棉拭子擦伤口腔黏膜,可以避免对口腔黏膜过大的创伤,同时白念珠菌更容易侵入黏膜组织。
本研究选用了舌背病损分数、口腔白念珠菌菌量和组织病理学来评估对白念珠菌在口腔黏膜的局部感染情况和变化。本实验研究结果显示小鼠接种白念珠菌后舌背病损存在一个由轻到重,再趋于稳定的变化趋势。接种第1天时舌背变化不明显,未见明显伪膜出现,在第3天舌背可见厚的伪膜,覆盖面积超过舌表面的90%,随后伪膜持续到第7天,虽然第7天伪膜面积不足90%。同样,口腔白念珠菌菌量也存在类似的变化趋势,在3~7 d口腔黏膜局部的白念珠菌菌量稳定于106~107 CFU/mL。此外,通过病理切片图片研究也证实在第3、5天病理组织均可见白念珠菌形成菌丝侵入上皮,上皮组织破坏严重,第7天黏膜上皮可见较多的酵母细胞。综合分析说明本研究成功构建了一个稳定的口腔黏膜白念珠菌感染模型,同时也呈现了一定的变化趋势,即在第1天时感染不甚严重,但在接种后1~2 d内感染迅速恶化(结果未显示),接种3~5 d感染进入稳定期,而到第7天时感染有所缓解。出现这种感染变化趋势的原因可能是感染后期药物效用减退,自身免疫能力逐渐恢复[19-20],或者小鼠度过了早期急性感染阶段,从而对白念珠菌有一定抵抗力[15]。
十六年前,有着优越家世的古意,顶着耀眼的光坏,就读于一所名牌大学,跟青梅竹马的女友十分相爱,已经准备谈婚论嫁。
在本研究的白念珠菌感染模型中,口腔中的白念珠菌会被吞咽或随饮水进入消化系统,可能会引起肠道白念珠菌感染甚至系统感染。本研究检测了组织包括肾、肝、下降结肠内载菌量和小鼠体重变化[21],以综合评估系统感染状况。研究中发现小鼠未出现系统感染,而是引起了肠道感染。上述结果与Takakura等报道结果[11]相一致。然而,Hisajima 等[21]研究结果显示肾、肝出现感染,提示系统感染的产生,分析原因可能与接种菌量、真菌菌种和感染接种方式不同有关;有的研究者也认为可能因动物个体的免疫机能、黏膜特征或黏膜上皮微生物菌群等差异而有所不同[22]。
综上所述,本实验在成功建立白念珠菌口腔黏膜感染ICR小鼠模型的情况下,观察感染情况变化,模拟了人体白念珠菌口腔黏膜感染情况,了解小鼠感染模型的变化规律,为相关动物实验提供理论指导。此外,本研究可以从局部表现和微生物方面为新的抗真菌药物的疗效评价提供参考指标。
在传统的城市建设过程中,会对环境产生严重污染,也会浪费大量的资源与能源,属于粗放型的发展模式。随着时间的推移,这种发展模式引起了十分严重的不良后果。为了加快城市化的建设进程,促进我国经济进一步发展,增强人们的生活质量与水平,只有通过生态城市的建设,才能为城市化进程的顺利发展提供保障。
[参 考 文 献]
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