牙髓干细胞对中枢神经系统疾病的治疗新进展

中枢神经系统(central nervous system, CNS)包括大脑和脊髓，是所有感官的知觉和运动输出的中枢。CNS的修复和再生能力非常有限，受损的神经元细胞凋亡后无法被取代，并且大多数损伤的CNS不能再生，因此对这个区域的损伤通常非常严重并且往往是不可逆的[1]。在大多数情况下，CNS功能丧失继发于神经元受损。干细胞可以作为一种新的神经元来源整合到神经组织中，取代已经损失的神经元，或作为一种营养因子源促进内源性神经元再生和存活，为修复CNS提供一个较好的治疗方法。牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSC)表达神经元标记物和分泌神经营养因子(neurotrophic factors，NTF)以及其神经源性分化的能力引起了广泛研究，为应用于治疗神经疾病和损伤提供了潜在可能[2-4]。

1 牙髓干细胞

1.1 DPSC的生物学特性

干细胞的应用是基于它们增殖和分化成新的特化细胞的能力，以便于组织的替换和再生。特别是，DPSC 的神经嵴来源和表达巢蛋白的特点证实这些细胞可以分化为功能性神经元，因此适合作为细胞来源替代损伤的神经细胞[2,5-7]。DPSC具有自我更新和多向分化潜能，如分化成软骨细胞、脂肪细胞、成骨细胞、成牙本质细胞、神经细胞，同时表达间充质干细胞样(如CD29、CD90、CD105、CD146、CD166、CD271)和神经干细胞样(如巢蛋白、神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP))干细胞表型标记物[2-3,6-9]。从拔除的智齿组织中可以提取到干细胞， 包括牙囊、牙髓和根尖乳头，而这些干细胞显示出间充质干细胞的特点，并具有良好的体外神经分化能力[4]。

1.2 DPSC的神经分化潜能

与其他来源相比，来源于牙髓的干细胞显示出最有效的神经源性分化潜力[4，10-11]。研究发现，在电刺激下，含有DPSC的培养基中含有更多的p Ⅲ微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白和少突胶质细胞，提示DPSC可以向成熟的多巴胺能神经元分化[12]。数据显示，DPSC在成神经诱导条件下形成了神经元的形态，并在基因和蛋白水平均表达神经元特异性标志物，并且表现出了与功能性神经细胞一致的钠电流以及形成了电压依赖性钠离子和钾离子通道[13]。将DPSC分化的前体神经细胞移植到有脑皮质病变的大鼠脑脊液中，这些细胞可以存活并整合到脑实质中，而后继续保持功能长达4周[14]。

1.3 DPSC的神经营养特性

现在人们普遍认识到，间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)的主要治疗作用是通过旁分泌产生的抗炎因子和营养因子发挥作用。各项研究表明，DPSC分泌和表达的NTF包括神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神经营养因子-3(neurotrophin-3，NT3)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-line derived neurotrophic factor，GDNF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血小板源性神经营养因子(platelet-derived neurotrophic factor，PDGF)[2,15-16]。这些神经营养因子有不同的功效和作用，NGF在促神经突生长中起主要作用，而BDNF和PDGF对神经保护更加重要[17]。研究证实，DPSC分泌的多种营养因子，如NGF、BDNF、NT-3、VEGF、PDGF和GDNF，超过其他类型细胞如骨髓(bone marrowmesenchymal stemcells, BMSC)和脂肪间充质干细胞(adipose-derived MSC, AMSC)的分泌水平[15,17]。报道称，DPSC源性因子可以促进轴突再生，移植到发育中的鸡胚后能够很好的介导轴突导向，作者证实了DPSC源性因子CXCL12是引导轴突生长的重要因素。这些结果表明了DPSC促进和引导轴突再生的潜能[18]。相反，胚胎干细胞和诱导多能干细胞则缺乏有效的证据支持其修复神经损伤方面的旁分泌能力[5]。因此，MSC，特别是DPSC代表了一个理想的修复和保护CNS损伤的细胞类型。

2 DPSC对中枢神经系统疾病的治疗

2.1 DPSC对脑损伤的修复

2.1.1 对创伤性脑损伤的治疗潜力 虽然在人的大脑中已经发现了神经干细胞，但是他们对中枢神经的修复作用有限，并且分离和扩增这些细胞也遇到了各种技术障碍和伦理问题。胚胎干细胞和诱导多功能干细胞也可以用于修复神经系统损伤，特别是用于细胞替代治疗，而且相比而言后者也克服了许多伦理问题。然而，利用人骨髓间充质干细胞的新疗法已经越来越受到人们的关注，尤其是通过分泌旁分泌因子刺激内源性修复过程，证明了其神经组织修复和再生的潜力[5,19-21]。一种有效的干细胞治疗脑损伤疗法，如创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)和中风，需要细胞能够很好的移植、整合并存留在大脑中。将DPSC移植到健康的脑组织中能刺激内源性神经干细胞的增殖和迁移，也增加了神经营养因子如睫状神经营养因子、VEGF和FGF在移植部位的表达[22]，显示了DPSC通过旁分泌机制对脑组织的调节潜力。

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2.1.2 对中风的治疗潜力 中风可以导致大脑的缺血性损伤，是死亡的第二大原因。将DPSC移植入局灶性脑缺血大鼠模型能够改善大鼠的前肢感觉运动功能，尽管移植4周后只有2%的DPSC成功迁移到病变部位[23]。DPSC主要分化能够表达GFAP的胶质细胞而不是神经元，提示DPSC发挥功能是间接的、通过旁分泌介导的，而不是直接替换因缺血性损伤丢失的神经元[23]。将DPSC移植到缺氧缺血性脑损伤的动物脑室中，结果表明DPSC可以促进神经元和神经胶质细胞的生存和形成，各种行为测试也证实了大脑功能的提高[24]。在小鼠缺氧缺血性脑损伤模型中使用脱落乳牙干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)，通过足部行为缺陷试验发现，SHED细胞移植改善了神经行为功能，同时也防止组织萎缩、减少内源性细胞凋亡的数量[25]。有趣的是，没有发现SHED细胞分化成为神经元和胶质细胞，提示SHED细胞的神经保护和功能改善的作用是由旁分泌介导的。

研究表明，牙髓干细胞(DPSCs)能够分泌β-淀粉样肽降解酶、脑啡肽酶(NEP)。牙髓干细胞与骨髓和脂肪干细胞相比，其分泌物中包含着更高浓度的血管内皮生长因子(VEGF)、趋化因子Fractalkine、单核细胞趋化蛋白1(MCP 1)和粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。而且与未处理的细胞相比，细胞经牙髓干细胞处理后，其分泌物能够通过提高细胞活力，从而更加显著地降低β-淀粉样肽的细胞毒性。此外，牙髓干细胞的分泌物刺激了内源性生存因子Bcl-2，降低了Bax调节的细胞凋亡。此外，在牙髓干细胞的分泌物中检测到了脑啡肽酶，并且在12 h内，它在体外成功地降解了β1-42-淀粉样肽。因此，牙髓干细胞通过旁分泌途径治疗阿尔茨海默病具有很大研究价值[28]。

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)会导致部分或完全的知觉丧失、下肢瘫痪，病情严重的会导致上肢瘫痪和呼吸停止。体外实验证明，DPSC通过含有硫酸软骨素蛋白多糖和髓鞘相关糖蛋白的抑制介质促进轴突生成，再生证明了DPSC通过旁分泌途径的治疗潜力。将DPSC移植治疗到SCI的病变部位，它们没有分化成神经元，但的确促进病变部位及病变周围组织在内源性神经元和神经胶质细胞的生存[4]。幸存的皮质脊髓束轴突再生的距离跨越了病变部位和生物素葡聚糖胺(biotinylated dextran amine，BDA)标记的部位，证实了从病变部位到脊髓远端产生了广泛的轴突再生。同时后肢运动功能也得到改善，测试结果显著好于接受BMSC或AMSC移植的动物。雪旺细胞样胶质细胞能够比未分化的DPSC分泌更高滴度的NTF，因此诱导DPSC分化成的雪旺细胞样胶质细胞可能具有更大的益处。在体外，这些雪旺细胞比DPSC更好地促进背根神经节细胞(来源于脊髓)突起的再生[29]。将SHED细胞向神经细胞系做预分化并移植到脊髓损伤部位提高了SCI大鼠的运动能力，这项结果同样证实了DPSC对中枢神经系统的修复和再生的治疗潜力[30]。

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2.2 DPSC对脊髓损伤的治疗潜力

2.1.3 对阿尔茨海默氏病和帕金森病治疗潜力 阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s diseases，AD)和帕金森病(Parkinson’s diseases，PD)为神经退行性疾病，特点是渐进性和永久性神经元的损失。β-淀粉样肽(Aβ)的沉积与神经元的退行性病变有关，是AD病人脑内老年斑周边神经元变性和死亡的主要原因[26]。利用体外AD / PD模型，将DPSC与海马和中脑的神经元进行共培养，并给予β-淀粉样肽或6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)，结果显示DPSC可以显著降低神经元毒性和死亡，这可能与DPSC表达的多种NTF有关，包括NGF、GDNF和BDNF[27]。

2.3 DPSC对视网膜修复的治疗

最近，有学者认为DPSC具有分化为视网膜神经节样细胞的潜力[34]。在FGF2和SHH的作用下，接种于三维纤维水凝胶的DPSC显示出分化为RGC的表型特征，包括RGC相关基因/蛋白的表达，如Brn3b。然而，还不清楚这些培养细胞是否是分化良好的 RGC，以及是否可以用来成功地整合到视网膜中以达到恢复视力的目的。还需要考虑是，DPSC分化的RGC需要再生出具有视神经全长的轴突才能发挥功能，但目前仍未实现这个目标[4]。

以往的原理研究证明，移植到眼睛内的初级光感受器整合到视网膜的外核层并恢复了视觉功能[23]。然而，在临床上从年轻供体眼睛获得大量的光感受器是不可行的[31-32]，因此需要一种替代AMD的治疗方法。理想的方法是获得一种可以扩增并分化为光感受器细胞的干细胞来源。研究表明，牙髓干细胞与受损的视网膜共培养后，可被诱导分化并有光感受器细胞表型[33]。这些感光细胞表达出视紫红质表型标记，但其功能活性尚未被证实。

一项研究使用EGF、bFGF和维甲酸将DPSC预分化为神经元样细胞，并移植到了TBI大鼠的脑脊液，这些细胞迁移到大脑的不同区域，包括病变部位，并且表现出神经元样细胞形态，同时表达具有功能性的钠/钾电流[14]。综上所述，我们认为这些研究结果证明了DPSC迁移并在中枢神经系统的病变部位存活的能力，为TBI提供一个适合的治疗措施。

视网膜是CNS的一部分，其修复能力也有限。视网膜的损伤可以有多种表现形式，包括感光体/视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell, RGC)的损失、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)、青光眼、轴突损伤(外伤性视神经病变)[1]。 眼部疾病可由退行性慢性病变如AMD引起，其特征是视网膜感光细胞和色素上皮细胞逐渐丧失。由于视神经受压变性，青光眼会导致RGC的变性，通常由于眼压升高。外伤性视神经病变(traumatic optic neuropathy, TON)与脊髓损伤相似，常常损害视神经，导致视觉功能丧失。

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最近的研究探讨了MSC通过旁分泌介导的机制修复视网膜的可能性[35]。RGC的死亡主要是由基本的生存要素(即NTF)供给不足引起的，实验表明重组NTF具有保护神经的作用，尽管这种作用是短暂的[8]。由于MSC/DPSC相对高表达一系列的NTF，探讨其神经保护作用具有重要意义。将DPSC与切断的原代大鼠RGC在 Transwell共培养系统中共培养， 两细胞群由一个半透膜分离，结果显示DPSC促RGC的生存及其突起再生，而将特定的融合蛋白NTF受体抑制剂加入到培养基时，这种神经保护/神经再生作用就消失了，说明这种效果在很大程度上依赖于NTF的分泌[15,17]。移植到玻璃体后，DPSC存活3周后，可以促进约40%的RGC存活，并明显促进RGC的轴突再生和病变部位疤痕的消除[14]。由于眼睛具有低免疫排斥特性，移植到玻璃体的DPSC与其他MSC有相近的存活时间，MSC的免疫抑制特性和玻璃体防止细胞迁移的约束性，使DPSC/MSC具备了长期治疗的潜力[5]。将DPSC移植入玻璃体后，RGC存活数目得到提高， 视网膜电图显示了RGC的电活动增强。在长达35 d的治疗中，DPSC在保护RGC存活和保存视功能方面明显优于较未做处理眼睛和BMSC/ AMSC治疗的眼睛。这是DPSC第一次在青光眼模型上测试，证明在临床试验中使用DPSC治疗各种眼部疾病具有重要意义[5]。

3 展 望

尽管DPSC研究在CNS的治疗领域取得了很大的进步，但是将DPSC用于中枢神经系统疾病的临床治疗仍面临诸多挑战。DPSC确切的作用机制还不为人所知。MSC/DPSC能分泌多种生物活性因子，而哪些因子在治疗中发挥关键作用尚不清楚。此外，虽然有大量的研究表明，治疗机制主要是分泌介导的，却不能完全排除DPSC分化为神经元和神经胶质细胞的作用。事实上，DPSC在体外可以成功分化而在体内分化很少，表明宿主环境发挥着重要的作用，研究哪些因素可以阻止体内分化，可能大大提高细胞替代治疗的应用潜力。移植的DPSC缺乏迁移到损伤部位的微环境中也可能是成功分化的限制因素。

对于临床应用来说，解决安全问题极为重要，将DPSC从拔出的牙齿中分离、培养和冷冻保存条件的标准化和最佳化以及满足监管要求均十分重要。不同捐赠者之间DPSC分泌NTF的变化可能对标准化过程提出了一个棘手的问题，或许可以利用它的分泌物，达到治疗效果的一致性[4,14,17]。另一个问题是，如何用干细胞正确的剂量达到最好的效果。例如，将骨髓间充质干细胞移植到动物的玻璃体中，随着骨髓间充质干细胞移植剂量的增加，轴突再生的程度增加[36]。需要进一步的工作以优化DPSC分泌NTF，例如通过改变培养条件优化或预分化细胞。最近的一项研究表明，DPSC预分化成雪旺细胞样神经胶质细胞后，NTF的分泌水平显著增加，并且在体外培养的背根神经节损伤脊髓损伤模型中与未分化细胞比较发现，它们能够进一步刺激轴突生长[29]。

李洪作认真思考状，说：“好像是一个男的，但其他的真没有印象了，唉，我也想为你们出出点子，我可是一个侦探爱好者，有什么线索我肯定第一时间告诉你，喂警官，你的名片给一张我好不？”李洪说到最后竟忘了紧张，又露出油嘴滑舌的本色。

4 总 结

DPSC在治疗损伤性和退行性神经系统疾病中具有巨大的潜力，移植后发挥作用的主要机制很可能是旁分泌介导机制，分泌NTF参与神经元的存活、轴突再生和功能恢复。细胞分化也可能发挥作用，特别是分化成神经胶质样细胞，然后作为NTF或髓鞘再生细胞的来源。DPSC作为研究热点的时间尚短，还没有临床试验测试它的临床疗效。然而，考虑到这些细胞巨大的治疗潜力，我们期待其在这个领域的研究迅速增长。预测基于DPSC的临床试验将在不太遥远的未来成为现实。

测量不确定度是测量结果的科学表达，也是测量结果可靠性、可比性和可接受性的基础［1］。目前，中国各行业实验室为实现与国际接轨，开始进行国家实验室认可评审，目的是评价测定结果的准确性，需对检测过程进行不确定度评定。根据实验室认可准则要求，在分析检测过程中，需要建立并应用评定结果的不确定度程序［2］。目前国内外文献报道关于分析方法测量不确定度的评定多见于食品分析［3，4］、环境分析［5，6］等领域，且在药物分析领域也得到了一定的应用［7，8］，并将得到越来越多分析工作者的重视。测量不确定度是对测量结果的定量表征，不确定度越小，测量结果越准，使用价值越大［2］。

[参 考 文 献]

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