骨髓间充质干细胞研究与应用概况

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells，BMSCs)是当下热点研究对象之一。1867年德国病理学家Cohnheim教授[1]在研究创口愈合过程中发现骨髓中存在一种非造血系统的多潜能细胞，但研究因为条件原因未能深入。后来有研究者[2]在20世纪60年代开展一系列开创性研究，发现从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样的细胞群，在塑料培养皿中呈集落样贴壁生长；1987年，又发现这种骨髓单核细胞可在一定的条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。培养增殖二十代后仍保有其多向分化的潜能。于是把这种多能细胞称为间充质干细胞(mesenchyma stem cell，MSC)。因为MSC于骨髓中含量最多，所以通常所指的MSC即BMSCs。由于它们来自骨髓结构，又是支持造血干细胞生长的滋养层组成部分，因此也有人称其为骨髓基质干细胞。研究人员从骨骼肌、脂肪、脐带血、肺等组织中分离出MSC，相继应用于很多疾病模型当中，在组织工程、细胞移植和基因治疗等领域的研究相当广泛，如今BMSCs已是最常研究的MSC之一[3]。

1　生物学特性

在相差显微镜下BMSCs与成纤维细胞很相似，呈梭形或纺锤形，体积较大。电镜下观察细胞核较大，内含少量细胞器，核质比大。细胞周期的研究表明，大多数细胞处于G0/G1期，经某些信号的诱导，可分化成为某种分化细胞，故其具有强大的分化增殖能力。有研究报道显示在体外培养的BMSCs增殖12代后仍可以保持正常染色体表型和端粒酶活性[4]。

根据2007年修订的《土的分类标准》[16](GB/T 50145—2007)，将峰值粒径进行粒组划分，得到表2。

本文首先采用熵权TOPSIS模型测度了新型城镇化视角下新疆产城融合发展水平，从产业发展、城镇发展、人的发展和产城人协同四个维度进行更深层次的分析，以期能够为新疆产业发展和城镇建设提供参考。此外，文章从六个方面分析了新疆产城融合发展水平的决定因素，并进行平稳性检验，检验结果表明本文实证结论是稳健的。研究发现：农业发展水平的提升、市场化程度的加深、持续的科技进步、对外开放程度的提高和人力资本的积累，对产城融合发展水平具有显著的促进作用；而金融支持水平的提升虽然对产城融合发展水平的提升具有促进作用，但是却并不显著。

BMSCs还可以分泌多种细胞因子如：白细胞介素-6 (interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-7(interleukin -7，IL-7)、白细胞介素-8(interleukin -8，IL-8)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor， M-CSF)、干细胞因子(stem cell factor，SCF)等，这些细胞因子可参与机体的多种调控。通过分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原蛋白、透明质酸酶、蛋白多糖等物质，在机体造血功能中发挥重要的作用[5]。在免疫调节方面，由于BMSCs无特异性表面标志，在细胞贴壁附着后不表达CD3、CD4、CD14、CD34、CD45等，也不表达主要组织相容性复合物分子(major histocompatibility complex，MHC)；较高水平表达MHC-Ⅰ类抗原而不表达MHC-Ⅱ类抗原和CD80，低表达CD86[6]，所以机体不易产生对外来BMSCs的免疫应答。通过静脉注射的方式植入BMSCs，试验受体并未发生免疫排斥反应，观察发现BMSCs在体内可长期存活、分化、迁移并发挥其重要的细胞功能。Wang[7]等研究BMSCs可能是通过抑制C3的活化，从而降低机体免疫排斥反应。Aggarwal[8]等将BMSCs和无关供者来源的外周血单个核细胞以1:10比例培养后，发现共培养组调节性T细胞比例增高，提示BMSCs可以通过提高调节性T细胞从而诱导免疫耐受。Ramasamy[9]等发现BMSCs对有丝分裂激活的CD4+T、CD8+T细胞有明显的抑制增殖作用，而通过流式细胞仪检测早期活化标志物并未发现很大变化，所以推论其免疫排斥较弱的原因之一可能是通过对细胞增殖的抑制作用实现的。这些研究显示了BMSCs在异体种植中有着重要的应用价值，为移植BMSCs提供了一定的理论依据。

2　分离、培养与鉴定

在成人骨髓中，BMSCs约占全骨髓有核细胞总数的0.001%～0.1%，数量比例极低，并且随着年龄的增加逐渐减少[10,11]。所以要想获得足量的BMSCs须通过分离、提取、扩增和纯化等手段。目前用于分离培养BMSCs的方法有主要有四种：全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、细胞表面分子标记分选法、细胞筛选法，其中以全骨髓贴壁法和密度梯度离心法较为常用。虽然细胞表面分子标记分选法、细胞筛选法分离提取的细胞纯度高，但相比其他两种方法，后两者技术操作难度大，成本高，故较少采用。密度梯度离心法是依据骨髓中各细胞成分的密度不同来筛选出来，此法得到的原代细胞纯度较贴壁筛选法高，但细胞活性差，细胞功能有退化。全骨髓贴壁培养法操作步骤简单，时间短，污染机会少，增殖快,很多实验中运用此法均能获得较稳定的实验结果。Li[12]等研究验证了用简单的粘附方法可以有效地富集高纯度的BMSCs，其表型特征及分化潜能都显示了干细胞的特征。分离出来的BMSCs需要在一定培养条件下才能生长增殖，在建立BMSCs培养环境时常用低糖型的DMEM，不同类型的胎牛血清对细胞的贴壁、增殖、分化等方面影响各不相同。另外，不同浓度的血清对培养体系也有差异。实际情况中，低糖DMEM加入约10%胎牛血清较有利于BMSCs的培养。过高的血清浓度会促进细胞增殖分化，使细胞老化，不利于BMSCs增殖生长。用纯度较高的血清培养，更有利于细胞的功能保留，其增殖速度也较快。过去的四十年里，BMSCs显示出相当大的治疗潜力，在众多生物医学学科中产生了越来越广泛的关注。然而，不同研究人员对其采用不同的分离和增殖的方法，所以研究成果之间也越来越难以进行比较，一定程度上阻碍了该领域的发展。为解决这个问题，国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出了三条最低的标准以定义人类BMSCs。首先，必须在标准培养条件下具有贴壁可塑性；第二，必须表达CD105、CD73、CD90并缺乏表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19和人白细胞抗原-DR(human leukocyte antigens-D-related，HLA-DR)表面分子；第三，必须具有在体外分化成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的能力[13]。虽然这些标准还有待完善，但相信用这样的方式将更方便研究人员之间的探讨与交流。

3　BMSCs治疗疾病的新进展

BMSCs作为一种新型的研究对象在基础研究和临床实践中有着诸多优点，其低免疫原性一定程度上避免了在自体/异体移植方面的免疫排斥。通常情况下只有在病理状态才能诱导激发强大的细胞更新能力。BMSCs可通过类似归巢作用的方式向特定的体内组织进行原位修复[14]。BMSCs已作为细胞治疗和基因治疗的种子细胞，广泛应用于神经病学、骨科学、心脏病学和血液病学等临床领域。由于BMSCs提取便利，易分离培养，排异反应不明显，能避免由伦理学问题而引起的争议，故可在很多疾病中作为细胞替代疗法的种子细胞。

3.1　BMSCs与缺血性脑卒中　Kim[15]等发现BMSCs可以同时减弱先天性和适应性免疫反应，减轻中枢神经系统损伤，减少局部缺血性脑卒中诱发强烈的炎症反应导致的白细胞向梗死区域募集。Zhang[16]等研究认为趋化因子(chemokine)CX3CR1活化Jak2-stat5alpha-ERK1/2信号，触发整联蛋白依赖的结构重组促使BMSCs向缺血损伤脑组织趋化性迁移，说明多因子共同作用影响BMSCs的迁移。Tsai[17]等为检测BMSCs分泌的神经营养因子的作用，取来自大鼠的BMSCs培养基对缺血卒中动物模型进行治疗，发现培养基能增强神经细胞之间的连接，在促进卒中后功能恢复等方面发挥效能。

3.2　BMSCs与肺纤维化　Guan[18]等发现在肺纤维化早期阶段，BMSCs可通过抑制前炎症信号通路和上调抗炎通路来保护受损的肺组织。Mei[19]等研究BMSCs能降低全身及肺部炎症反应，较大程度上降低炎症因子水平，促进炎症修复。最近Li[20]等通过修饰BMSCs用慢病毒转染方法过表达骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein 7，BMP-7)基因，能显著降低经二氧化硅诱导处理的大鼠肺纤维化程度。这提示用BMP-7-BMSCs治疗方法可作为矽肺病的潜在治疗干预措施。另有研究结果表明，BMSCs对二氧化硅诱导的肺纤维化产生抗纤维化作用，可能主要与旁分泌机制有关，而不是分化作用[21]。

3.3　BMSCs与骨疾病　Daltro[22]等采用自体BMSCs移植治疗89例镰刀形红细胞合并股骨头早期坏死患者，随访5年发现BMSCs移植组的疼痛显著减轻，病程发展变慢。但是BMSCs移植治疗股骨头坏死最好应用在疾病的早期。Taketani[23]等研究同种异体骨髓移植，再用BMSCs移植治疗2例重症致死性低磷酸酯酶症：骨髓移植2周后，将BMSCs按1～2×106/kg静脉注射，2例分别接受4次和9次BMSCs注射。随访3年发现其骨骼发育状态均得到显著改善，但骨骼结构和速度依然异于正常儿童。同种异体BMSCs移植的治疗方法显著改善患者的身高、体重和四肢长度，提高患者的运动能力评分，延长存活时间。Dai[24]等进行了40例BMSCs移植治疗颈椎损伤造成的慢性完全脊髓损伤患者的随机对照研究，治疗组10例临床症状包括电刺激、轻触觉、针刺感觉和残余尿量都明显改善，且其中有9例创伤严重等级得到降低，神经电生理检测结果和临床症状改善结果一致；对照组中则无一例显著改善。

3.4　BMSCs与肝脏疾病　Xie[25]等研究表明干扰素-β抗原(interferon-β，INF-β)基因修饰的BMSCs可以有效地通过抑制AKT/FOXO3a途径减少肝癌细胞在体外和体内的增殖。Hang[26]等在急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)中发现，BMSCs分化为肝细胞可能不是主要的治疗作用，在损伤部位炎症因子刺激下，一方面，BMSCs凭借向损伤部位趋化的能力，通过血液循环迁移到受损部位参与修复；另一方面，BMSCs合成多种生长因子，以及具有可以抑制炎性应答的细胞因子，刺激内源性细胞增殖和血管增生等。Zhang[27]等发现BMSCs通过增加血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)表达来改善急性肝衰竭，降低多形核细胞(polymorphonucleocyte，PMN)的浸润和功能，可能与核因子-κB激活的抑制有关，从而起到重要的抗炎和抗凋亡作用。

3.5　BMSCs与肾脏疾病　Mohamed[28]等的研究结果表明：在病理组织学和超微结构的高血压肾病中BMSCs发挥了相当大的逆转作用。此外，免疫组化结果清楚地指出BMSCs通过Nrf2通路相关作用对肾功能有肯定的疗效。Hamza[29]等使用BMSCs治疗确定糖尿病和糖尿病肾病的情况时，有显著的疗效。Anan[30]等发现BMSCs与氯沙坦对阿霉素引起的肾损害有一定的治疗潜力，BMSCs可以通过降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达和增加增殖细胞核抗原染色来影响肾脏再生。

4　小结与展望

BMSCs是目前研究的热点，其所具有的低免疫原性特点仍是其他类型干细胞无法比拟的。但同以往分离扩增方法相比，目前获得BMSCs的手段仍需改进。 如何获得均一的细胞群体，如何准确区分BMSCs与其他类型的细胞，如何稳定传代，移植干细胞疗法的最佳时机以及在移植后如何保证细胞活性，这些问题仍需要进一步实验进行深入探讨与研究。我们相信，随着在组织工程和细胞工程、基因工程的研究中对这些问题的不断深入，BMSCs在临床治疗中的应用也更为可行。

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