甲基化转移酶基因在乳腺癌组织中的表达及意义

乳腺癌是一种发生在乳腺组织中的恶性疾病。据不完全统计，2015年我国女性全年龄段恶性肿瘤中乳腺癌发病率排在首位，且发病率呈逐渐升高、发病年龄逐渐年轻化的趋势[1]。有研究结果表明在乳腺癌的发生发展过程中抑癌基因的高甲基化和癌基因的低甲基化起到非常重要的作用，而甲基化与甲基化转移酶(DNMT)的活性有关[2～5]。本文采用实时荧光定量PCR技术检测乳腺癌组织以及对应的癌旁组织中DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b基因相对表达水平及与临床病理特征之间的关系，分析其改变在乳腺癌发生、发展以及预后过程中的作用。

1　资料与方法

1.1　一般资料　收集我院2012年3月～2013年12月新鲜乳腺癌组织标本53例，年龄38～64岁，中位年龄50.4岁；另收集同次手术的癌旁组织20例(部分病例由于边界不清未收集)。所有的新鲜组织清洗掉表面血迹后立即放入室温保存的RNAlater溶液中，4℃过夜保存，然后-80℃保存。所有标本均经过病理证实，均未经过放化疗。

1.2　主要仪器与试剂　100bp DNA mark (Fermentas公司)；PCR试剂(上海生工)；RG-BOX紫外凝胶成像系统(Gene公司)；SYBR GreenⅠ染料(Gene公司)；Reverse Transcription System A3500、Trizol Reagent(Promega公司)；PE7500(ABI公司)；CF-16RX台式高速冷冻离心机(日立公司)；RNAlater(美国Invitrogen公司) ； ND-2000微量核酸定量仪(美国Thermo Fisher公司) 。

1.3　方法

1.3.1　引物合成　GAPDH：5-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3'，5- GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3'，扩增产物226bp；DNMT1：5-CGA CTA CAT CAA AGG CAG CAA CCT G-3，5-TGG AGT GGA CTT GTG GGT GTT CTC-3，扩增产物166bp；DNMT2：5-AAG CTG TAA GCC AGC CCA TAT AC-3，5-TCA GCA GTG AAC AGA ACC TAC ATG-3，扩增产物148bp；DNMT3a：5-CGA GTC CAA CCC TGT GAT GAT TG-3，5-GCT GGT CTT TGC CCT GCT TTA TG-3，扩增产物221bp；DNMT3b：5-TTG GAA TAG GGG ACC TCG TGT G-3，5-AGA GAC CTC GGA GAA CTT GCC ATC-3，扩增产物152bp[6]。

1.3.2　RNA提取及逆转录　所有组织标本取出后滴加液氮碾碎。按照说明书要求提取总RNA，经微量核酸定量仪ND-2000测定上述步骤提取的RNA纯度和浓度后将其溶于无RNA酶的ddH2O中，用于后续的逆转录。逆转录体系为：总RNA 2μL， Oligo(dT)引物 1μL，10mmol/L dNTP混合液2μL，25mmol/L MgCL2 4μL ，Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor 0.5μL，AMV逆转录酶0.6μL，10×Buffer 2μL， ddH2O补齐体积至20μL。短暂瞬时离心后进行逆转录，条件为42℃15分钟，95℃5分钟。逆转录后的cDNA用于mRNA扩增或者-80℃备用。

1.3.3　PCR扩增　10×Buffer 3μL、2mmol/L dNTP 1.5μL、5U/μL Taq 0.3μL、25mmol/L Mg2+ 2.4μL、10×SYBR-GreenⅠ1μL、上下游引物各2μL、cDNA 5μL，ddH2O补齐体积共25μL。扩增AMFR mRNA 的条件为：95℃4分钟，94℃40秒，60℃35秒，72℃40秒共35个循环，95℃15秒，60℃30秒，72℃1分钟收集溶解曲线。

1.3.4　结果判断　10μL扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳1小时后在34bp、166bp、148bp、221bp、152bp、416bp处出现特异性的目的条带，并根据熔点曲线判断扩增的特异性。利用Ct值和扩增效率E，以GAPDH的量为参照，2-△t计算DNMT mRNA相对表达量。

1.4　统计学分析　应用SPSS 16.0统计软件分析所有计量资料，两独立样本采用t检验，数据以表示，以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　DNMTs mRNA在乳腺癌及癌旁组织中的表达水平　本研究发现，四种DNMTs mRNA在乳腺癌组织中的相对表达均高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.001)。四种DNMTs在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达见表1和图1。

 

表1　DNMTs在乳腺癌组织及癌旁组织中表达水平比较

  

nDNMT1DNMT2DNMT3aDNMT3b癌组织530．57±0．270．58±0．290．56±0．270．61±0．26癌旁组织200．20±0．100．17±0．120．18±0．130．19±0．17t8．17．575．347．92P<0．001<0．001<0．001<0．001

  

图1　DNMTs在乳腺癌及癌旁组织中的表达

 

注：1：Marker；2：GAPDH；3、5、7、9：癌组织；4、6、8、10：癌旁组织

2.2　四种DNMTs的表达水平与乳腺癌临床病理参数之间的关系　本研究结果显示，除DNMT2以外，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的表达水平在乳腺癌是否淋巴转移之间的差异具有统计学意义，而与其他临床病理参数之间的差异没有统计学意义，见表2。

信息化教学是产生于现代、主要依托信息技术展开教学活动的一种新型教学方式。通常是指借助网络等一系列资源和功能营造出有趣的学习环境，并将其能够提供的图像、文字以及声音等各种信息进行结合从而对学生感官发生作用，为教学活动的高效开展提供支持的一种教学手段。将信息技术应用到小学语文教学活动中，对于学生学习质量和课堂教学效果的提升具有积极的促进作用，本文对此展开探讨。

 

表2　DNMTs与乳腺癌临床特征之间的关系(n=53)

  

病理特征例数DNMT1tPDNMT2tP年龄≥50岁230．51±0．26⁃1．080．290．52±0．33⁃1．340．19<50岁300．59±0．270．63±0．24肿块大小≥5cm160．60±0．300．290．480．60±0．270．860．40<5cm370．54±0．260．51±0．30T期T1+T2200．53±0．26⁃0．690．520．54±0．32⁃0．070．93T3+T4330．58±0．280．57±0．28N期N0250．43±0．27⁃2．710．010．54±0．27⁃0．710．49N+280．68±0．240．62±0．29M期M0340．51±0．26⁃0．610．310．53±0．33⁃1．010．14M1190．59±0．280．57±0．36

  

病理特征例数DNMT3atPDNMT3btP年龄≥50岁230．51±0．26⁃1．410．160．54±0．34⁃0．790．44<50岁300．61±0．260．60±0．30肿块大小≥5cm160．60±0．300．540．60．59±0．311．560．12<5cm370．55±0．260．45±0．33T期T1+T2200．53±0．26⁃1．160．250．60±0．31⁃1．050．31T3+T4330．62±0．270．52±0．35N期N0250．46±0．26⁃2．850．0070．41±0．27⁃3．50．002N+280．66±0．240．66±0．22M期M0340．47±0．21⁃1．310．340．56±0．34⁃0．510．61M1190．52±0．250．61±0．32

3　讨论

乳腺癌的发生机制一般主要包含有两种，遗传学和表观遗传学，其中表观遗传学机制在乳腺癌的发生、发展过程中起着越来越重要的作用。其机制包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化、染色质重塑、Micro-RNA等，其中DNA启动子区域的异常甲基化的研究最为深入，DNMT活性或者功能表达水平的改变可能会诱导机体产生部分疾病甚至肿瘤的发生[7]。目前研究发现DNMT包括有DNMT1、DNMT2、DNMT3a和DNMT3b等4种亚型，DNMT1、DNMT3a和DNMT3b等在胚胎形成及发育、诱导疾病中发挥重要的作用，但DNMT2的作用机制目前还不很清楚[8]。

下面讨论连续控制律式（11）下的稳定特性。设有某bang-bang控制律τ2使系统收敛到不变集，即（x）=Exx4τ2≤ 0。由式（14）知，-λTb 与 τ2同号，故Exx4τ2≤ 0→λTbExx4≤ 0，此意味式（10）的控制律也能使系统收敛至不变集。

研究表明，肿瘤细胞在一部分抑癌基因高甲基化的作用下可以使甲基化转移酶表达水平高于正常细胞[9]； DNMT1基因在膀胱癌组织中可以检测出过表达[10]； DNMT3b基因在肝癌细胞株有过表达[11]。赵琳[12]等研究发现，DNMT1表达水平在淋巴转移的乳腺癌组织中显著高于非淋巴转移的组织；王勇[13]等研究发现，没有发生淋巴转移的乳腺癌患者DNMT3a的表达水平要低于有淋巴结转移的乳腺癌患者，并且通过研究发现DNMT3a、DNMT3b表达阳性与该疾病的转移、病程以及预后有关。

本文研究发现，四种DNMTs在乳腺癌组织中的表达水平均明显高于对应的癌旁组织，表明DNMTs在乳腺癌的发生过程中可能起到重要作用。并且除DNMT2外，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的表达与淋巴转移有关，这与淋巴转移是乳腺癌主要的转移路径相符，表明DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的表达可能与乳腺癌的发展以及预后有关。为了能更好的分析DNMTs的表达在乳腺癌发生、发展以及预后中的作用，后续的研究将主要着重于乳腺癌中DNMTs的表达与表观遗传之间的关系，以及通过回访调查不同DNMTs表达患者的生存时间，更进一步的研究乳腺癌患者的预后因素。

综上所述，在乳腺癌中DNMTs存在高表达，这种高表达可作为乳腺癌预后检测一种分子指标。

参考文献

[1] Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132

[2] Tang Q,Holland-Letz T,Slynko A,et al.DNA methylation array analysis identifies breast cancer associated-RPTOR,MGRN1 and RAPSN hypomethylation in peripheral blood DNA[J].Oncotarget,2016,39(7):64191-64202

[3] Jezkova E,Kajo K,Zubor P,et al.Methylation in promoter regions of PITX2 and RASSF1A genes in association with clinicopathological features in breast cancer patients[J].Tumour Biol,2016,15(11):1-12

[4] Spangle JM,Dreijerink KM,Groner AC,et al.PI3K/AKT signaling regulates H3K4 methylation in breast cancer[J].Cell Rep,2016,15(12):2692-2704

[5] He K,Zhang L,Long X.Quantitative assessment of the association between APC promoter methylation and breast cancer [J].Ncotarget,2016,7(25):37920-37930

[6] 李海平,余宗涛,范金波,等.肝癌组织中DNA甲基化转移酶基因表达的分析[J].临床肝胆病杂志,2013,29(7):5525-528

[7] Medina-Franco JL,Caulfield T.Advances in the computational development of DNA methyltransferase inhibitors[J].Drug Discov Today,2011,16(9-10):418-425

[8] Qin W,Leonhardt H,Pichler G.Regulation of DNA methyltransferase 1 by interactions and modifications[J].Nucleus,2011,2(5):392-402

[9] Fang JY,Lu R,M ikov its JA,et al.Regulation of hMSH2 and hMLH1 expression in the human colon cancer cell line SW 1116 by DNA methyltransferase 1 [J].Cancer Lett,2006,233(1):124

[10] 朱　进,单玉春,阳东荣.膀胱癌中DNA甲基转移酶1表达的实时定量检测[J].中华泌尿外科杂志,2008,29(12):28-30

[11] 许　军,樊　红,赵主江,等.RNAi及DNA芯片分析肝癌细胞系中受DNMT3b调控的下游基因[J].遗传学报,2005,32(11):11151

[12] 赵　琳,于兆进,何　苗,等.三阴性乳腺癌中DNMT1表达与ERα基因启动子甲基化的关系[J].现代肿瘤医学,2016,24(9):1376-1379

[13] 王　勇,王晓东,陈文捷,等.散发性乳腺癌中DNMT3a、DNMT3b表达与ER阿尔法基因启动子甲基化状态及蛋白表达的关系[J].天津医药,2015,43(5):500-504