女性原发性痛风性关节炎患者三磷酸腺苷结合盒蛋白G2基因表达的意义

痛风性关节炎(gouty arthritis, GA)是由于机体内尿酸增高、尿酸盐结晶在关节周围沉积而引起的一种临床炎性关节疾病[1]。外周血尿酸水平稳定对于平衡尿酸重吸收和排泄分解起着重要作用，如果平衡被打破，则引起高尿酸血症，进而会导致痛风发生的风险[2]。但有部分痛风患者机体内的尿酸水平不高，表明其发病并不完全与高尿酸血症密切相关[3]。三磷酸腺苷结合盒蛋白G2基因(ATP-binding cassette superfamily G2 gene,ABCG2)位于4q22.1，该基因是一种尿酸盐转运体，对机体血尿酸水平调节有很大影响，如果该基因编码的蛋白异常，机体尿酸排泄能力降低，进而导致痛风[4]。本文就女性原发性GA患者体内ABCG2 mRNA表达水平与尿酸水平的相关性进行研究，旨在为从基因角度阐明GA的发病机制提供一定理论依据。

1　资料与方法

1.1　研究对象　收集我院2015年9月～2016年10月门诊及住院125例女性原发性GA患者为观察组，包括急性痛风性关节炎(AGA)62例和间歇期痛风性关节炎(IGA)63例，年龄40～78岁；其中绝经期女性90例，非绝经期女性35例；根据年龄不同分为<50岁组28例(其中AGA8例，IGA20例)、50～65岁组55例(其中AGA30例，IGA25例)、>65岁组42例(其中AGA19例，IGA23例)。原发性GA的诊断根据美国风湿病协会制定标准[5]，且排除其他原因所导致的继发性痛风。收集同期40名健康体检女性为对照组，排除肝、肾脏疾病及糖尿病、痛风、自身免疫性疾病等影响因素。

1.2　主要试剂和仪器　淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品有限公司)；100bp DNA marker (Fermentas公司)；逆转录试剂盒A3500、RNA提取试剂(Promega公司)；SYBR GreenⅠ染料(Gene公司)；PCR试剂盒与DNA marker(上海生物工程有限公司)。

1.3　方法

1.3.1　外周血单个核细胞(PBMCs)的分离　密度梯度离心法分离外周血进而获取PBMCs，末次离心后PBMCs用1mL磷酸盐缓冲液继续重悬一遍细胞。最后将分离的PBCMs保存到-80℃的EP管中。

1.3.2　引物合成　GAPDH：F:GAA GGT GAA GGT CGG AGT C，R:GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC，扩增产物226bp；ABCG2：F:TGG CTT TCT ACC TTG TCG，R:CGA AGA TTT GCC TCC ACC，扩增产物100bp。所有引物合成由上海生物工程有限公司完成。

1.3.3　RNA提取与逆转录　采用一步法快速提取PBMCs总RNA，测定其纯度和浓度后溶于无RNA酶的双蒸水中并逆转录为cDNA。逆转录的cDNA用无RNA酶双蒸水稀释cDNA至100μL，用于mRNA扩增或者-80 ℃备用。

1.3.4　PCR扩增　PCR扩增体系2mmol/L dNTP 1.5μL、10×Buffer 3μL、25mmol/L Mg2+ 2.4μL、5U/uL Taq 0.3μL、上下游引物各2μL、10×SYBR-GreenⅠ1μL、 cDNA5μL，用无菌水补齐体积共30μL。扩增条件：95 ℃ 5分钟，94℃ 30秒，60 ℃ 30秒，72℃ 60秒共40个循环；最后一步收集熔点曲线的过程95℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟。

1.3.5　结果判断　通过熔点曲线判断扩增特异性，然后再取5μL扩增产物与指示buffer混匀后，2%琼脂糖凝胶进行电泳，120V电压电泳1h，切断电源，紫外凝胶成像系统分析结果。在100bp、226bp处出现特异性目的条带。并利用检测得到Ct值和扩增效率E，以GAPDH mRNA的量为参照，计算ABCG2 mRNA相对表达量。

ABCG2 mRNA/GAPDH mRNA=(1+EGAPDH)Ct(GAPDH)/(1+EABCG2)Ct(ABCG2)

1.4　尿酸的检测　外周血尿酸检测采用全自动生化仪(AU2700，贝克曼)以及配套的试剂进行测定。

1.5　统计学处理　应用SPSS 16.0统计软件进行结果分析，所有计量资料采用两独立样本t检验，数据以表示，相关性分析采用Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　各组ABCG mRNA和尿酸水平比较　观察组中AGA、IGA患者外周血中ABCG2 mRNA和尿酸水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05/0.01)；AGA组和IGA组之间ABCG2 mRNA和尿酸水平差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。绝经期女性外周血中ABCG2 mRNA相对表达水平为(0.41±0.35)，非绝经期女性为(0.18±0.10)，两者比较差异有统计学意义 (P<0.05)。

 

表1　各组中ABCG2和尿酸水平比较

  

组别nABCG2mRNA尿酸(μmol/L)观察组　AGA组620．41±0．35∗#538．7±210．7∗∗#　IGA组630．29±0．27∗389．4±137．0∗∗对照组400．13±0．08268．3±70．1

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与IGA组比较，#P<0.05

2.2　不同年龄段女性GA患者的ABCG2 mRNA的表达　<50岁组、50～65岁组、>65岁组女性GA患者ABCG2 mRNA表达水平依次为(0.16±0.08)、(0.33±0.27)、(0.50±0.39)，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。并且在不同年龄组中AGA组和IGA组的ABCG2 mRNA表述水平差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

 

表2　不同年龄和不同分期组中ABCG2 mRNA表达水平比较

  

分组n<50岁50～65岁>65岁AGA620．21±0．11∗0．39±0．30∗0．64±0．39∗IGA630．14±0．060．25±0．190．39±0．36

注：与IGA组比较，*P<0.05

2.3　ABCG2 mRNA表达水平与尿酸相关性分析　采用Pearson相关性分析显示，GA患者ABCG2 mRNA表达水平与尿酸水平呈正相关(r=0.35，P<0.001)。

3　讨论

痛风是一种常见炎性关节疾病，受环境、遗传因素等影响。高尿酸血症与痛风之间有一定关联，是其发病基础[6,7]。流行病学研究表明，高尿酸血症和原发性痛风患病率较国外较低，分别为13.3%、1.1%，并且男女发病率约为18:1，绝经期后女性发病率显著提高，且临床症状不如男性明显[8]，故大多研究集中于男性，而对女性患者研究较少[9]。ABCG2基因位于4q22.1，大量表达于肾近曲小管刷状缘膜上，负责尿酸排泄以及调节分泌尿酸盐的功能，并且对尿酸分泌具有“年龄依赖性”和“性别特异性”，既对女性尿酸水平的调节能力随着年龄增长而逐渐增强[10]。所以本文从基因表达水平对女性GA患者进行研究，可以为其患病筛查提供新依据，并对其早期预防及治疗提供一定理论依据。

根据GB/T 19073—2008《风力发电机组齿轮箱》的加载试验要求为：按25%、50%、75%的额定负载各运转30 min，按100%额定负载运转120 min，110%超负载运转30 min，120%超负载运转5 min。针对这些要求，试验台所使用的变频电动机必须要有很高的可靠性。

本研究中我们采用SYBR-Green染料结合PCR的实时荧光定量可以较为准确检测外周血中ABCG2基因表达水平。本研究发现GA患者PBMCs中ABCG2基因表达水平要高于对照组；进一步对GA进行分组发现，AGA和IGA组中表达水平均高于对照组，表明该基因表达变化在痛风发生过程中起到一定作用：作为尿酸盐转运体的ABCG2可能通过从近端肾小管转运进而影响血尿酸水平，其功能异常可以导致尿酸排泄能力下降，改变体内尿酸平衡，进而导致高尿酸血症，引起痛风发生[11]。绝经期女性的ABCG2基因表达水平相对高于非绝经期女性，根据年龄段进行分组后发现，随着年龄增加，基因表达水平逐渐增高，表明女性患者发病可能与雌激素保护作用有关[12]。并且由于ABCG2基因表达与尿酸有关，表明饮食结构变化可能与痛风发生有关[13]，但更多可能是尿酸以及基因表达改变导致功能变化共同作用的结果，这也从另一个方面阐述了GA发病机制多样化[14]。

2007年，萨科齐当选法国总统后，新总理菲永组阁，拉加德出任法国经济、财政和工业部部长，她是法兰西第五共和国自1959年建立后的第一任女性财长，也是八国集团历史上出现的第一位掌管经济的女部长。由于在应对国际金融危机中“措施及时得当”以及在国际金融监管等一系列谈判中展现出良好的外交能力和娴熟的谈判技巧，2009年11月，英国《金融时报》评选她为“欧元区最佳财长”。

综上所述，对女性GA患者的ABCG2基因表达及其与尿酸之间相关性进行研究，可以为了解女性特别是绝经后女性GA发病机制提供一定理论基础，并且由于ABCG2基因编码的蛋白异常(特别是发生基因变异时)，可致机体尿酸排泄能力降低，进而导致发生痛风的风险增加，所以在我们后续的研究中应该从基因变异与基因型位点层面进一步阐明女性原发性GA的发病机制，为其后续治疗提供一定理论依据。

参考文献

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