粪便中miRNA-424表达用于结直肠癌诊断和筛查的价值

世界上存在三种恶性肿瘤，结直肠癌为之一，还是肿瘤相关性死亡主要因素[1]。肿瘤的复发及晚期转移，是患者死亡主要原因，尽管肿瘤的病死率，也因结直肠癌根治术的应用而大大降低。在早期患者的症状较不明显，所以通常诊断时已经成为中晚期，因此提升患者预后及降低病死率的重要措施，是早期筛查和诊断[2,3]。现如今在检测早期结直肠癌中，已经有一些蛋白标记物及检验方法获得应用，如CA125、CA19-9、癌胚抗原(CEA)、粪便隐血试验等。然而此类检验方法，早期检测肿瘤的目的并未能达成，不具备太强的敏感性。结肠镜和病理检查，便是当前诊断结直肠癌金标准，50岁以上及更高年龄段人群，是临床上较为适用的年龄层[4]。但是行结直肠镜检查可能会产生较高的费用，造成被检者的不适，当前并未在发展中国家获得广泛应用。如CT和MRI均是影像学检查非侵入性的及有效性的检查，然而有较低的对早期肠道肿瘤的检出率，以及存在辐射、高费用，影响了其应用于筛查结直肠癌中。MicroRNA经18～25个核苷酸组成[5,6]，影响细胞的转移、凋亡、增殖、迁徙的功能，参与调控近1/3的人类基因[7]。在多种肿瘤中它的异常表达获得证实，包括结直肠癌。此次研究基于之前的基因芯片数据分析，以及结直肠癌高通量测序结果，以及对结直肠癌 miRNA 的研究，选择的是表达差异显著且稳定、特异性好的miRNA，分析其在结直肠癌诊断中的价值，结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 在我院于2016年3月至2017年3月进行诊断治疗36例结直肠癌患者作为观察组，对患者的和相应癌旁正常组织标本、术前粪便标本、术中肿瘤组织，以及临床资料进行收集，并同时选取36例健康体检人群的粪便。将所有粪便及组织中的RNA分别提取出来，对各标本中10个miRNA的表达量，用RT-PCR 检测，选出CRC患者及健康人群中，以及 CRC 组织与癌旁组织的表达存在差异的 miRNA，对miRNA 对结直肠癌的诊断价值的评估，用受试者工作曲线(ROC)。排除曾接受过肠道手术，患有炎症性肠病、免疫性疾病的患者。患者的病理在术前、术后，都被诊断为直肠癌及结直肠癌。此次研究所有患者均签订了知情同意书。观察组中，男20例，女16例；年龄(24～75)岁，平均年龄(56.40±2.15)岁；直肠癌21例，结肠癌15例；依据TNM分期，Ⅲ期23例，Ⅳ期3例，Ⅰ期2例，Ⅱ期8例；术后病理示无淋巴结转移9例，有淋巴结转移27例。

1.2 采集标本 术前2组患者均取晨便样本，在术的前3 d未经结肠镜、灌肠等侵入性操作。要求粪便样本>1 g[8]，大概是黄豆大小，仅对成形粪便采集进行进一步的分析，在 2 ml RNAfixer 液的试管中将其放入进行保存，4℃ 过夜，之后转移到-20℃冰箱备用。要采集相应正常黏膜组织标本(病理明确切缘阴性，距肿瘤10 cm结直肠黏膜)[9]，以及新鲜结直肠癌组织标本，在手术中标本离体后，每个组织标本的长宽<0.6 cm，厚度<0.3 cm，存放于液氮罐中，第2天转移到-80℃冰箱备用。可把粪便完整性分为三个等级：(1)软状：粪便形状完整，边缘不显著，呈半固体状，转运中难保其形成；(2)硬状：可在转运中保持形状，粪便的边缘和形状均较清晰；(3)水状：粪便呈现的是液体状混合物。

1.3 检测方法 按照文献对于结直肠癌miRNA 的研究，以及之前基因芯片数据分析及结直肠癌高通量测序结果，选择出下述 10 个miRNA进行研究：分别是miRNA221、miRNA222、miRNA96、miRNA143、miRNA17、miRNA18a、miRNA181b、miR-NA92a、miRNA21、miRNA31[10,11]。相应 miRNA 序列，查询地应是官方网站上，美国国家生物技术信息中心的，对所需引物的合成，应委托北京天根生物有限公司。对试剂盒(FP401)的定量检测，取天根 miRcute miRNA 荧光，进行实时荧光定量 PCR，每样本做 3 个重复，以 U6作为内参，按说明书操作，对基因表达量的检测采用2-△Ct法[12,13]。

tPA在血液循环中能被肝快速清除，导致其体内半衰期非常短，约5 min［16］。这一性质也使得人们在利用tPA进行溶栓治疗时需要持续泵注或注射相对大剂量的tPA。

1.3.1 样本 miRNA 的提取

潞新矿区内变形较大且较难控制的巷道基本都是实体煤掘进巷道，掘进过程中均出现煤炮频繁、煤体自行片冒、迸射等强烈矿压显现现象。冲击性载荷是造成潞新矿区巷道掘进成形困难和变形量大的主要原因，而冲击性载荷的根源则主要包括高应力、煤岩体的储能特性及结构特性。

1.3.1.1 粪便样本提取miRNA:①需离心10 min装有粪便样本的 RNAfixer 试管 4℃ 12 000 r/min，将其中的液体倒掉，并将 1 ml TRIpure加入到每管进行混匀，放置在常温下10 min时间；②加入0.2 ml 氯仿后，花15 d时间将每支试管摇匀，5分钟时间静置，并4℃ 12 000 r/min离心 15 min；③另外将 0.5 ml 异丙醇加入到新 1.5 ml 离心管每管中，-20℃冰箱放置1 d，抽取离心上清液加入；④要再次离心 15 min，当第2天取出离心管后，保留底部沉淀物，但是倒掉液体；⑤将无水乙醇 0.5 ml加入到每管中，摇匀再花费15 min时间离心，保留沉淀物，倒掉液体，晾干 5 min；⑥要放置于-80℃冰箱保存，且每管加入 DEPC 水 50 μl 溶解。

2.2 癌旁正常组织及癌组织中各 miRNA 的表达差异 相较于癌旁正常组织，观察组患者癌组织的 miRNA-143 的相对表达量较低，但是 miRNA6、miRNA221、miRNA31、miRNA92a、miRNA17、miRNA21相对表达量较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

综合本组病例，我们认为晚期甲状腺癌需尽量保留1～2枚甲状旁腺，以保证术后甲状旁腺功能正常。目前还可以使用纳米碳负显影，或者术中甲状旁腺检测，但是对于累及喉气管和食管的晚期肿瘤，实现的可能性不大，此种情况下以保护对侧远离肿瘤的甲状旁腺为首要任务。

1.4 观察指标 将所有粪便及组织中的RNA分别提取出来，对各标本中10个miRNA的表达量，用RT-PCR 检测，选出结直肠癌患者及健康人群中，以及结直肠癌组织与癌旁组织的表达存在差异的miRNA，对miRNA对结直肠癌的诊断价值的评估，用受试者工作曲线(ROC)[14,15]。

1.3.2.2 纯度质量检测:需要选择3 μl核酸染色剂+0.2 g琼脂+30 ml电泳液，也就是说琼脂糖凝胶及 1%电泳液，为了促使可以充分的溶解，需要在微波炉中加热2 min时间，倒在模版中冷却成冻胶块备用。之后选择 0.1 μl loading buffer + 0.3 μl提取的 miRNA 混合之后填孔进行电泳，用电脑观察色带，需要保持120 V 15 min后，对miRNA 纯度进行判断。当能够说明总 RNA 纯度无显著讲解，以及达到实验的要求，则显示三条色带均较为清晰。

1.3.2.1 浓度检测:需取 Nanodrop 2000检测提取的RNA，1.8～2.0是A260/A280值，且针对于PCR 测定的要求，RNA 的质和量基本符合。用 Thermo 进行 2 μl 提取的 RNA的浓度测定，选择 DEPC 水棉球，擦净探头，在检测之前取 DEPC 水测试归零。于检测完成样本之后，需再检测下一样本，选择清洁探头进行。

1.3.3 miRNA 逆转录为 cDNA:选择miRNA cDNA 第一链合成试剂盒，是天根 miRcute 增强型，把miRNA 逆转录为 cDNA，下面将是存在的具体步骤：①逆转录体系的配制:在冰中将MiRNA RT Enzyme Mix 放上备用，并把 2×miRNA RT Reaction Buffer解冻且混匀，把下述试剂加入反应管内，为冰上预冷RNase Free的，致使总体积20 μl，MiRNART Enzyme Mix最后加入。放在碎冰上缓慢解冻已取提的 RNA，按照测的RNA 浓度取量进行配制：MiRNA RT Enzyme Mix试剂的体积是2 μl；Total RNA试剂的终浓度是2 μl；RNase-Free ddH2O的体积需要补至 20 μl，2×miRNA RT Reaction Buffer试剂的体积是10 μl，终浓度是1×。②逆转录程序:经短暂离心(5 min，4℃)之后，以及针对上述配制的反应液，用移液器轻轻混匀，之后进行逆转录反应。当反应时间是3 min，温度是95℃，则说明酶失活反应；当反应时间是60 min，温度是42℃，则说明miRNA 加 A 尾反应和逆转录反应。可在-20℃的温度下保存合成的 cDNA 反应液，并行下游荧光定量检测。在行下游荧光定量检测时，需把 cDNA 反应液稀释10～1 000倍后使用。

在当今世界，任何一个国家要获得快速发展，都离不开对外贸易。各国通过对外贸易参与国际分工，发挥本国优势，可以从中获得巨大的经济利益。作为世界上人口最多的发展中国家，我国拥有庞大的劳动力。改革开放以来，特别是我国加入世贸组织以来，我国对外贸易快速增长，大量农村劳动力转移到非农外贸部门，参与国际生产分工。劳动力低成本是我国参与国际分工和国际竞争突出的比较优势。

1.3.2 检测miRNA的纯度及浓度

结构域(L613-P1193)，且距离催化中心位置(H959-H963)[3]非常近，推测L983P可能通过空间构象的改变影响ACE蛋白的催化功能，但以上两个变异位点如何真正影响蛋白功能仍需要进一步的功能验证和分析。

2 结果

2.1 2组中各miRNA 的表达差异 相较于对照组的健康人群，观察组患者的粪便中的 miRNA-92a、miRNA-21、miRNA-31相对表达量较高，差异有统计学意义(P<0.05)，而miRNA-143 的相对表达量较低(P<0.05)。见表1。

 

表1 2组各miRNA 的表达差异

  

miRNA对照组粪便观察组粪便t值P值miRNA18a1.41±0.161.44±0.130.8731>0.05miRNA171.29±0.121.23±0.141.9524>0.05miRNA92a1.26±0.181.98±0.1319.4563<0.05miRNA211.24±0.311.87±0.387.7079<0.05miRNA961.21±0.061.22±0.052.0301>0.05miRNA311.58±0.552.21±0.216.4206<0.05miRNA2211.68±0.191.66±0.152.0301>0.05miRNA1432.52±0.151.87±0.362.0301<0.05miRNA2221.79±0.151.73±0.141.7545>0.05miRNA181b1.57±0.161.62±0.122.0301>0.05

1.3.1.2 组织样本提取 miRNA:①需将大概是 0.2 cm×0.3 cm的组织剪切小块从试管中取出，在装有 0.5 ml TRIpure的 1.5 ml 离心管中将其放入，用小剪刀在离心管中快速剪碎组织，且进行每次研磨不超过10 s的研磨棒研磨。之后需将0.5 ml TRIpure加入到每管中，常温下放置10 min；②加入0.2 ml 氯仿后，花15 s时间将每支试管摇匀，5 min时间静置，并4℃ 12 000 r/min离心 15 min；③另外将 0.5 ml 异丙醇加入到新 1.5 ml 离心管每管中，-20℃冰箱放置1 d，抽取离心上清液加入；④要再次离心15 min，当第2天取出离心管后，保留底部沉淀物，但是倒掉液体；⑤将无水乙醇 0.5 ml加入到每管中，摇匀再花费15 min时间离心，保留沉淀物，倒掉液体，凉干 5 min；⑥要放置于-80℃冰箱保存，且每管加入 DEPC 水 50 μl 溶解。

1.5 统计学分析 应用SPSS 21.0统计软件，计量资料以表示，采用t检验，采用单因素方差进行多组间比较，相关分析采用 Pearson，检测结直肠癌的临床诊断价值，P<0.05为差异有统计学意义。

2.3 对CRC各粪便 miRNA 诊断价值 粪便AUC 较大的有 miRNA92、miRNA143、miRNA21、miRNA31。见表3。

2.4 粪便 miRNA-92a、miRNA-21、miRNA-143、miRNA -31两两组合对 CRC 的诊断价值：AUC 经组合之后都大于0.9，其中达到0.997的是miRNA-143+ miRNA-21，特异度及敏感度是0.952、0.974。见表4。

3 讨论

从粪便中成功将高纯度的miRNA提出，通过对定量分析方法的优化、粪便样本处理、 miRNA 提取，且针对结直肠癌，粪便 miRNA 可以作为其生物标志物。而肿瘤的病死率，因结直肠癌根治术的应用而大大降低。在早期患者的症状较不明显，所以通常诊断时已经成为中晚期，因此提升患者预后及降低病死率的重要措施，是早期筛查和诊断。现如今在检测早期结直肠癌中，已经有一些蛋白标记物及检验方法获得应用，如CA125、CA19-9、CEA、粪便隐血试验等。然而此类检验方法，敏感性不强，早期检测肿瘤的目的也无法达成。结肠镜和病理检查为现如今对结直肠癌的进行诊断的金标准，50岁以上及更高年龄段人群是临床上适用的年龄层。但是这样的检查费用较高，造成被检者不适，当前并未在发展中国家获得广泛应用。之后在临床上被广泛开发应用的，是一种较为简化的粪便 miRNA 的检测方法，在诊断结直肠癌上miRNA 具有极大的优势。

传统蒽环类药物目前依然广泛地用于治疗各种恶性肿瘤，但其骨髓抑制和心脏毒性等不良反应严重限制了临床应用。脂质体阿霉素的心脏毒性、骨髓抑制、脱发等不良反应较传统蒽环类药物显著降低，能否取代传统蒽环类药物有待进行更多、更大规模的临床研究加以验证。

 

表2 癌旁正常组织及癌组织中各 miRNA 的表达差异

  

miRNA癌旁组织癌组织t值P值miRNA18a1.33±0.141.32±0.130.3141>0.05miRNA171.33±0.112.23±0.1529.0306<0.05miRNA92a1.13±0.142.05±0.806.7967<0.05miRNA211.23±0.172.52±0.2327.0623<0.05miRNA960.96±0.071.87±0.1239.3019<0.05miRNA311.22±0.182.64±0.2031.6643<0.05miRNA2211.41±0.111.47±0.191.6398>0.05miRNA1431.79±0.072.22±0.1021.1362<0.05miRNA2221.42±0.101.53±0.124.2252<0.05miRNA181b2.18±0.162.42±0.205.6223<0.05

 

表3 各miRNA对CRC的诊断价值

  

单个miRNAAUC95%CIP值特异度截断值敏感度miRNA18a0.5280.362～0.695>0.050.3081.3040.874miRNA170.3830.235～0.532>0.050.2031.1640.624miRNA92a0.0010.640～0.877<0.050.8001.4000.64miRNA210.0000.786～0.983<0.050.8500.3640.924miRNA960.7470.381～0.670>0.050.6031.2340.474miRNA310.0000.769～0.985<0.050.8011.9840.874miRNA2210.2420.249～0.563>0.050.2561.5790.574miRNA1430.0000.451～0.990<0.050.9212.1640.474miRNA2220.1710.237～0.544>0.050.1071.6140.7miRNA181b0.2030.441～0.760>0.050.6921.6140.54

 

表4 粪便 miRNA-92a、miRNA -21、miRNA-143、 miRNA -31两两组合对 CRC 的诊断价值

  

两两组合miRNA P值95%CIAUC特异度敏感度miRNA92a+miRNA143<0.050.000～10.0000.9830.9550.974miRNA31+miRNA143<0.050.000～10.0000.9950.9500.974miRNA21+miRNA143<0.050.000～10.0000.9970.9520.974miRNA21+miRNA31<0.050.851～0.9930.9220.7510.974miRNA31+miRNA92a<0.050.857～0.9890.9230.7490.874miRNA21+miRNA92a<0.050.888～10.0000.9440.7500.974

相较于DNA、蛋白， miRNA 更加稳定，且不容易降解，在72 h内，粪便中的 miRNA 能够保持和原含量差不多水平，给粪便样本从临床收集——完成检测，提供充足的时间，同时减少检测产生的误差。在细胞中，现如今 miRNA 保持稳定性的机制尚不确定， 通过与特定的 DNA-RNA 蛋白结合，特定的 miRNA 能够防止降解。在血浆中，miRNA 用于保持稳定性，可通过一种抵抗血浆酶活性的形式。在行 miRNA 筛查前，相较于粪便 OB，是不需要限制饮食的。miRNA 检测，和突变和甲基化检测比较需要的费用及样本量均较少，操作也较为简单， RT-PCR 的操作过程及费用均占据一定的优势。除此之外，因检测血液不容易被查处，所以早期癌及癌前病变，所以粪便中肠黏膜细胞，较长时间范围都不断脱落，所以认为早期筛查中，粪便 miRNA 检测可作为方法。在进行实验之前，事先选择10个基因进行检测，分别是miRNA221、miRNA222、miRNA96、miRNA143、miRNA17、miRNA18a、miRNA181b、miR-NA92a、miRNA21、miRNA31。在此次研究中，所有的 患者粪便、健康人粪便、结直肠癌组织、癌旁组织中，均可检测出上述miRNA，说明在粪便中， miRNA 作为结直肠癌肿瘤标志物进行诊断的可行性。本文检测了36例结直肠癌患者的癌旁组织及癌组织的 miRNA，结果显示相较于癌旁组织，结直肠癌患者癌组织的miRNA-96、miRNA221、 miRNA31、miRNA92a、miRNA17、miRNA21相对表达量较高，相较于癌旁组织，miRNA143 的相对表达量较低，和之前存在的报道有相似之处。文章选取36例结直肠癌患者，作为观察组，在我院于2016年3月至2017年3月进行诊断治疗，对患者的和相应癌旁正常组织标本、术前粪便标本、术中肿瘤组织，以及临床资料进行收集，并同时选取36例健康体检人群的粪便。将所有粪便及组织中的RNA分别提取出来，对各标本中10个miRNA的表达量，用RT-PCR 检测，选出结直肠癌患者及健康人群中，以及结直肠癌组织与癌旁组织的表达存在差异的 miRNA，对miRNA对结直肠癌的诊断价值的评估，用ROC。相较于对照组的健康人群，观察组患者的粪便中的 miRNA-92a、miRNA-21、miRNA-31相对表达量较高，差异有统计学意义(P<0.05)，而miRNA-143 的相对表达量较低(P<0.05)；相较于癌旁正常组织，观察组患者癌组织的 miRNA-143 的相对表达量较低，但是miRNA96、miRNA221、miRNA31、miRNA92a、miRNA17、miRNA21相对表达量较高，差异有统计学意义(P<0.05)；粪便AUC 较大的有 miRNA92、miRNA143、miRNA21、miRNA31；AUC 经组合之后都大于0.9，其中达到0.997的是miRNA-143+ miRNA-21，特异度及敏感度是0.952、0.974。

综上所述，在CRC患者与健康体检人群间，以及癌旁正常和结直肠癌组织间，均检测到 miRNA92a、miRNA143、miRNA21、miRNA31的表达有明显差异，联合的miRNA143+ miRNA21，对结直肠癌具有良好的诊断价值。

参考文献

1 许安东,朱云祥,汤晓飞,等.粪便中miRNA-424在结直肠癌诊断和筛查中的应用.实用临床医药杂志,2016,20:16-19.

2 Huang L,Shen Z,Xu Q,et al.Increased levels of microRNA-424 are associated with the pathogenesis of fetal growth restriction.Placenta,2013,34:624-627.

3 Zhao HR,Wang J,Gao L,et al.MiRNA-424 protects against permanent focal cerebral ischemia injury in mice involving suppressing microglia activation.Stroke:A Journal of Cerebral Circulation,2013,44:1706-1713.

4 Boldrup L,Coates PJ,Laurell G,et al.Downregulation of miRNA-424:a sign of field cancerisation in clinically normal tongue adjacent to squamous cell carcinoma.The British journal of cancer,2015,112:1760-1765.

5 李志华,李绍鹏,魏春勇,等.miRNA在食管鳞癌癌变机理中的作用研究.海南医学,2015,26:1885-1886,1887.

6 许安东.粪便中miRNA-424在结直肠癌诊断和筛查中的应用.扬州大学,2016.

7 吕晶晶.蛋白质组学技术在结直肠癌、食管癌筛查、诊断中的应用.第二军医大学,2010.

8 尹建浩,张昊,孟磊,等.粪便SPG20、FBN1及VIM基因启动子甲基化联合检测在结直肠癌诊断中的意义.陕西医学杂志,2017,46:414-416.

9 王静,张金平,桂银莉,等.人血浆及粪便中微小RNA-92a-1表达水平在结直肠肿瘤筛查中的意义.中华消化杂志,2012,32:834-837.

10 王继恒,李世荣.我国结直肠癌筛查和早期诊断十年回顾:1994～2005.胃肠病学,2006,11:245-250.

11 江振作,张春泽,王跃飞,等.基于肠道微生物代谢产物的人结直肠癌诊断方法研究.分析化学,2016,44:1178-1184.

12 黄彦钦,蔡善荣,张苏展,等.中国结直肠癌人群筛查方案的应用价值初探.中华预防医学杂志,2011,45:601-604.

13 黄沁园,何纯刚,陈利生,等.p33生长抑制基因1b甲基化在结直肠癌组织及粪便中的检测.中华实验外科杂志,2015,32:698-700.

14 单宏鹏,张猛,陈锋,等.广西南宁西乡塘地区结直肠癌全结肠镜筛查结果分析.山东医药,2017,57:94-96.

15 吴东,杨红,李玥,等.外周血甲基化Septin9基因联合粪便免疫化学试验对专科门诊患者结直肠癌和腺瘤的筛查.中华消化杂志,2016,36:107-112.