天麻提取物对H2O2所诱导SH-SY5Y细胞的神经保护作用

现代社会人们的生活节奏加快、生活压力变大，同时由于环境恶化等原因，使得以阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)和抑郁症等为代表的神经退行性疾病成为困扰人类的重要威胁之一。由于神经系统损伤、神经营养不足等导致的神经细胞的退化、凋亡等是神经退行性疾病的主要病症之一。相关的药物研发成为当前的研究热点，研究发现氟西汀可以调控脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表达，从而具有潜在的抗抑郁功效[1]。Matsumoto等[2]通过构建一个无血清培养基培养的大鼠神经元细胞，从而导致神经元细胞凋亡的模型筛选出一个命名为FU248的化合物，该化合物可以调控包括神经生长因子(nerve growth faltor,NGF)、BDNF、NT在内的多种神经营养因子，并抑制神经元细胞的凋亡。最新研究结果显示一种名为dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS)的化合物具有神经保护和神经应用作用[3]。然而这些化合物往往不良反应较多而且容易导致耐药性，故应用前景相对较差。天然产物的抗抑郁、抗神经衰弱及应对AD疾病的研究也有一些相关报道涉及，如红景天提取物、银杏叶提取物等天然产物分别可以调控老龄大鼠海马内NGF、BDNF和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF)的表达[4,5]。而一些复方中药制剂如定志小丸、参乌胶囊等也具有相似的活性[6,7]。此外，有研究发现雷公藤氯内酯醇可以在活体内诱导神经轴突的延长，同时可以诱导BDNF的表达[8]。本研究以天麻提取物处理损伤造模后的神经纤维瘤细胞SH-SY5Y，观察、检测其对损伤神经细胞的神经保护作用，进而检测与之相关的神经营养因子的表达，从而揭示天麻的神经保护作用及其作用机制，为这一天然产物在神经退行性疾病中的深入研究和应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 中药材天麻购自云南文山州，经浙江农林大学中药学科钱永常教授鉴定，为中药天麻正品。

1.2 实验仪器及试剂

1.2.1 实验仪器：MCO-18AIC型细胞培养箱，购自日本三洋公司；DMI3000型荧光倒置相差显微镜，购自美国徕卡公司；生物安全柜，购自新加坡Esco公司；Agilent 1100型高效液相色谱系统，购自美国安捷伦公司；ABI 2700型PCR仪，购自美国ABI公司；CFX-96型实时荧光定量PCR系统，购自美国Bio-rad公司；ELIX3型制水机，购自美国Millipore公司；MULTISKAN FC型酶标仪，购自美国Thermo公司；生物凝胶成像系统，购自美国Bio-rad公司。

1.2.2 试剂：ECM培养基和胎牛血清购自美国HyClone公司，盘尼西林和链霉素购自美国Sigma公司；MTT细胞增殖检测试剂盒，购自生工生物工程(上海)有限公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；RNA反转录试剂盒及实时荧光定量试剂盒购自日本TOYOBO公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等常规分析纯试剂购自浙江常青化工有限公司。

高龄老年人群是股骨粗隆间骨折的高发人群，经非手术途径治疗股骨粗隆间骨折患者在一年后死亡的发生率高达20%，髓内钉治疗是不稳定股骨粗隆间骨折患者的最佳治疗方式，而髓内、髓外固定对于稳定性股骨粗隆间骨折均适用，股骨粗隆间骨折是否稳定的关键是内后侧皮质是否连续，内侧弓的完整性与后侧皮质的粉碎程度是决定股骨间粗隆稳定与否的两个重要因素。

1.4 H2O2对SH-SY5Y细胞的损伤处理 将细胞按照104/孔的浓度种于96孔细胞培养板，按照“1.3 细胞培养”中所述的方法培养。培养24 h后在培养基中加入终浓度为0.2 mmol/L的H2O2，显微镜下观察处理后的SH-SY5Y细胞与未处理的细胞的差异，将损伤造模成功的细胞用于下一步实验。

1.3 细胞培养 SH-SY5Y细胞购自中国科学院典型培养物保藏库，细胞用添加10%胎牛血清(FBS)和0.3%抗生素(盘尼西林和链霉素)的DMEM细胞培养基培养，放置于37℃细胞培养箱，环境CO2浓度为5%。细胞每2天更换1次培养基。

2.1 天麻提取物处理SH-SY5Y细胞后的形态观察 本研究首先用H2O2处理SH-SY5Y细胞，并在处理后的细胞培养及中加入天麻提取物，观察天麻提取物对损伤后SH-SY5Y形态的影响。结果显示，H2O2处理后，SH-SY5Y细胞的形态与未处理的细胞存在较大的差异，细胞突触消失，外缘形状变为钝圆型。而经天麻提取物处理后，细胞突触正常，形状为不规则多边形，与未用H2O2处理的细胞形态较为相似。见图1。

1.6 RNA抽提及实时荧光定量PCR 将SH-SY5Y细胞种于6孔细胞培养板，24 h后分别加入终浓度为0、0.1、1、10、100 μg/ml的天麻提取物，置37℃细胞培养箱抚育24 h。然后弃去6孔板中的细胞培养基，每孔加入1 ml TRIzol裂解处理后的SH-SY5Y细胞，TRIzol试剂法提取总RNA。具体方法如下：(1)将处理后的SH-SY5Y细胞每6孔细胞培养板加入1 ml TRIzol试剂，用移液器反复吹打使细胞裂解充分，并静置5 min。向混合液中加入0.2 ml氯仿，振荡15 s，室温静置10 min后在4℃条件下12 000 g离心15 min。将上层清液转移到新的无核酸酶离心管中。加入0.5 ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10 min后在4℃条件下12 000 g离心10 min，弃去上清液。加入1 ml 75%乙醇(现配，并置于冰上一段时间)，轻轻洗涤沉淀，在4℃条件下7 500 g离心5 min，弃去上清液。将沉淀晾干，加入20 μl经DEPC处理后的去离子水溶解。(2)提取的SH-SY5Y细胞总RNA首先用Nanodrop 2000测定浓度和纯度，然后用ReverTra qPCR RT Master Mix反转录试剂盒反转录为cDNA。首先将RNA溶液用金属浴65℃温浴5 min，并置于冰上急冷，以使含有复杂结构的RNA变性。之后根据测定的浓度吸取1 μg RNA，按照试剂盒的说明书经过去除基因组DNA和逆转录的步骤后制备得到cDNA，作为荧光实时定量PCR反应的模板。(3)合成的cDNA用于进行实时荧光定量PCR(qPCR)，以人β-Actin基因为内参基因。首先用Thunderbird SYBR qPCR Mix实时荧光定量试剂盒检测BDNF、NGF和内参基因β-Actin的引物的扩增效率，确保各对基因的扩增效率位于0.9～1.1。继而用Thunderbird SYBR qPCR Mix实时荧光定量试剂盒检测不同样本之间BDNF和NGF的基因表达的差异。实时荧光定量PCR仪器为Bio-rad CFX-96 touch型实时荧光定量PCR仪。见表1。

1.7 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件，One-way ANOVA法分析不同处理的数据间的差异显著性。

预制光缆采用分散配线方式时，由于预制光缆分散至各个屏柜，单个屏柜的预制光缆根数不多，可选择预制舱内屏柜或户外机柜其中一端进行盘整，直接将光缆余长就近于屏柜盘起，扎紧，就近放置于屏柜周边光缆槽盒内或屏柜底下方，也可通过柜内固定板高低根据现场实际情况进行适当调整，满足光缆余长的要求。

瘦素(1eptin)是蛋白激素。在鱼类，瘦素主要由肝合成分泌，参与调节摄食、代谢、生长、神经及造血细胞发育、免疫、繁殖等[1]。

 

表1 qPCR所用的引物

  

PrimersPrimersequencesAccessionnumbersBDNF-FCTCTGACCCTGCCCGCCGAX60201.1BDNF-RGACCTTTTCAAGGACTGTGACCGTCNGF-FCCACACTGAGGTGCATAGCGTAATXM_002506NGF-RCCTCCTTGCCCTTGATGTCTGTβ-actin-FGCGTGACATTAAGGAGAAGCTGTGNM_001101β-actin-RTCCACACGGAGTACTTGCGCT

1.5 MTT试剂法 在损伤造模成功的SH-SY5Y细胞的培养基中分别加入终浓度为0、0.1、1、10、100 μg/ml的天麻提取物，37℃条件下分别抚育24 h后换液加MTT，将MTT与培养基混合均匀，使MTT含量为培养基体积的10%，37℃孵育4 h，4 h后用移液器弃掉含MTT的培养基，并用PBS清洗2遍，后每孔加入200 μl的DMSO用于溶解紫色结晶物质，因此弃培养基以及用PBS清洗时应注意不能把结晶清洗掉。加入DMSO后将96孔板置于摇床上低速振荡30 min，使紫色结晶充分溶解，后使用酶标仪在490 nm处检测每个孔中溶液的吸光度值，记录实验结果。每个处理设置4个机械重复，并处理3批细胞作为3次生物学重复。

2 结果

矿体长度能反映矿体赋存空间的分布状况[4]，矿体的长度的双对数图可分为2段(图4)，其对应的D值分别为0.16889、2.19450，表明矿体具有两种就位空间，层间滑动剪切带和区域性断裂旁侧次级脆-韧性剪切带。结合矿体的特征，产于层间滑动剪切带中的矿体长度分维数为2.19450，产于区域性断裂旁侧次级脆-韧性剪切带中矿体长度分维数为0.16889。D值越小，矿体长度差异性越大，空间分布越不均一[5]。

  

图1 天麻提取物处理H2O2诱导后SH-SY5Y细胞的形态，图中标尺=50 μm

2.4 天麻提取物对SH-SY5Y细胞中神经生长相关基因表达的影响 为了探索天麻提取物保护H2O2损伤SH-SY5Y细胞的机制，本研究对不同处理SH-SY5Y细胞中NGF、BDNF等神经生长相关基因的表达进行检测，结果显示，H2O2损伤处理后的SH-SY5Y细胞中NGF、BDNF的基因表达均显著低于未损伤细胞(2个基因的表达均不到未诱导处理细胞中基因表达量的20%)，而损伤后的SH-SY5Y细胞再用天麻提取物处理，可以显著上调相关基因的表达，其中，当天麻提取物浓度达到10 μg/ml时，NGF的表达量相比未添加天麻提取物处理的H2O2损伤处理样本上调7倍左右，当天麻提取物浓度达到100 μg/ml时，NGF的表达量相比未添加天麻提取物处理的样本上调6倍左右，均为基因表达的最高值，且与未添加天麻提取物处理的H2O2损伤处理样本比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

表2 天麻提取物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞 突触生长影响的方差分析

  

组别平均值未诱导57.74±2.780μg/ml9.78±0.950.1μg/ml12.59±4.41μg/ml28.19±3.49*10μg/ml45.73±3.64*100μg/ml57.27±1.95*

注：与0 μg/ml比较，*P<0.01

2.3 天麻提取物对SH-SY5Y细胞增殖的影响 本研究进一步用MTT试剂法检测了天麻提取物对H2O2损伤细胞的保护作用。实验结果显示，H2O2处理后严重影响了SH-SY5Y细胞的增殖，使得细胞增殖率仅为未处理细胞的(58.72±4.63)%。而经天麻提取物处理后，在天麻提取物浓度较低的情况下(0.1 μg/ml)对损伤SH-SY5Y细胞增殖的影响并无显著差异，但是在较高浓度的天麻提取物处理后(>0.1 μg/ml)，损伤的SH-SY5Y细胞增殖显著高于未处理的损伤SH-SY5Y细胞，当使用100 μg/ml的天麻提取物处理H2O2损伤诱导的SH-SY5Y细胞时，其细胞增值情况达到未使用H2O2损伤诱导的SH-SY5Y细胞的(99.08±3.65)%，基本体现了对H2O2损伤诱导处理的良好的修复效果。见表3，图3。

  

图2 天麻提取物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞突触生长的影响

注：与0 μg/ml比较，*P<0.01

 

表3 天麻提取物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞增殖影响的方差分析

  

组别平均值未诱导100.00±4.540μg/ml58.72±4.630.1μg/ml60.43±1.331μg/ml74.42±4.11*10μg/ml98.26±2.41#100μg/ml99.08±3.65#

注：与0 μg/ml组比较，*P<0.05,#P<0.01

  

图3 天麻提取物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞增殖的影响

注：与0 μg/ml组比较，*P<0.05；与0 μg/ml组比较，#P<0.01

2.2 天麻提取物对SH-SY5Y细胞突触生长的影响 在观察细胞形态的基础上，本研究同时对天麻提取物处理后的SH-SY5Y细胞的突触长度进行了测定。结果显示，H2O2处理后，SH-SY5Y细胞的突触长度显著变小，未诱导处理的SH-SY5Y细胞神经突触长度可以达到(57.74±2.78)μm，经过H2O2损伤诱导处理后神经突触长度降低至(9.78±0.95)μm。而经过H2O2损伤诱导处理后的SH-SY5Y细胞经天麻提取物处理后，在天麻提取物浓度较低的时候(0.1 μg/ml)不表现明显的神经细胞损伤修复活性，在较高浓度天麻提取物处理后(>0.1 μg/ml)，突触长度明显变长，变化呈现计量效应，当使用100 μg/ml的天麻提取物处理后SH-SY5Y细胞的神经突触达到了(57.27±1.95)μm，接近于未使用H2O2损伤诱导处理的细胞。见表2，图2。

 

图4 天麻提取物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞神经营养因子基因表达的影响

注：与0 μg/ml组比较，*P<0.05，#P<0.01

3 讨论

传统医药业是中华民族奉献给世界的最宝贵的礼物之一，中国传统药物在包括中国在内的世界许多国家成为筛选新型药物的研究热点。神经退行性疾病是困扰当今社会的难题之一，从传统药物中筛选具有治疗神经退行性疾病的潜在活性的物质是本文试图解决的一个问题。本研究中，传统药物天麻的水溶性提取物被证明具有神经保护活性，且其机制可能与调控神经营养因子的表达有关。相关结果一方面说明天麻可以作为神经保护性的传统药物使用，另一方面，对天麻提取物中的神经保护活性因子进行分离筛选，具有将其开发为新型神经保护药物的前景。

天麻作为我国传统的中药材，常用来治疗用脑过度、神经衰弱、失眠、头痛、头晕、老年性痴呆、帕金森氏症等病症，天麻具有显著地镇定作用和抗惊厥作用。天麻包含酚类、多糖类、有机酸类和甾醇类等在内的多种活性成分。其中，主要活性成分是天麻的酚类成分，其具有抗惊厥、镇痛、降压及保护神经细胞等作用,因此天麻素被认为是天麻的主要成分[9,10]。天麻多糖是天麻的另一类活性成分，具有促进天麻素的吸收、降低血压、延缓衰老、增强免疫、抗氧化等作用[11]。研究表明，天麻素能明显降低β淀粉样蛋白抗体(1-42)的神经毒性，过氧化氢酶和SOD的含量及活性也相应提高，上调Nrf2的基因表达和ERK 1/2的磷酸化，而ERK 1/2通路可能参与天麻素对Aβ(1～42)原代培养的大鼠海马神经元氧化作用的保护[12]。

帕金森疾病是最常见的神经退行性疾病之一，是由于脑内多巴胺(DA)减少所引起的。研究发现，神经

毒素MPTP通过多巴胺能神经元细胞而导致类似于PD的症状，将天麻素处理MPTP中毒小鼠，能减轻MPTP对小鼠中脑的氧化应激作用，提高ERKl/2的活性，从而提高Ⅱ期解毒酶和抗氧化酶的水平，并最终减少受试小鼠行为学的改变[13]。在研究天麻素对MPTP诱导的人多巴胺SH-SYSY细胞和PD小鼠的神经保护作用时发现，天麻素不但能呈剂量依赖性地调节该细胞中由MPTP刺激产生的自由基、Bax/Bcl-2 mRNA、caspase-3和PARP而达到神经保护作用，也能改善PD模型小鼠的运动迟缓和运动障碍[14,15]。这些结果表明，天麻素可通过降低神经元细胞的氧化作用达到有效防治退行性神经疾病的目的。然而本研究中对天麻提取物通过影响NGF和BDNF从而具有神经修复活性进行了研究，但是，对于其中功能成分是否与天麻素相关，还需要进一步研究。

2015年药典中，液相－电感耦合等离子体质谱联用法（HPLC－ICP－MS）是常见测定方法之一。由于HPLC－ICP－MS是一种新型元素和同位素分析技术，具有检出限低、动态线性范围宽、干扰少、分析精密度高和分析速度快等优点，可同时完成多元素测定，具有极高的检测效率，是痕量、超痕量元素分析领域最先进的方法之一［9，10］。 因此，采用 HPLC－ICP－MS手段对中药重金属含量进行测定，进而采取质量控制手段，对于规范中药采集、运输、加工饮片及制剂过程中可能引入的重金属进行监控和规范有重要的现实意义。

参考文献

1 de Foubert G,Carney SL,Robinson CS,et al.Fluoxetine-induced change in rat brain expression of brain-derived neurotrophic factor varies depending on length of treatment.Neuroscience,2004,128:597-604.

2 Matsumoto K,Yamamoto K,Karasawa Y,et al.Possible involvement of induction of brain-derived neurotrophic f actor in the neuroprotective effect of a 5-phenylpyrimidine derivative.Biochem Pharmacol,2003,66:1019-1023.

3 Marcus K,Stone M,Heidemarie K,et al.Neuroprotective-neurotrophic effect of endogenous dehydroepiandrosterone sulfate during intense stress exposure.Steroids,2014,5:1-5.

4 金沈锐,秦旭华.红景天提取物对初老大鼠海马中神经生长因子和脑源性神经营养因子含量影响.中国中药杂志,2004,29:480-481.

5 李育臣,董玉娟,王建茹,等.银杏叶提取物对脑缺血大鼠脑源性神经营养因子的影响.中风与神经疾病杂志,2005,22:54-56.

6 张如意,李林,张兰,等.参乌胶囊对拟亨廷顿病大鼠行为及脑内神经营养因子的影响.北京中医药大学学报,2003,26:34-38.

7 秦旭华,金沈锐,王建.定志小丸对老龄大鼠海马中神经生长因子和脑源性神经营养因子含量的影响.中药药理与临床,2001,17:7-8.

8 Li FQ,Cheng XX,Liang XB,et al.Neurotrophic and neuroprotective effects of tripchlorolide,an extract of Chinese herb Tripterygium wilfordii Hook F,on dopaminergic neurons.Exp Neurol,2003,179:28-37.

9 王飞,位凯,沈兵,等.天麻素预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用.中国药学杂志,2012,23:1905-1910.

10 李瑶,杨萍,何花,等.天麻素抑制血清剥夺诱导的H9C2心肌细胞自噬发挥抗凋亡作用.中国新药杂志,2016,25:328-333.

11 汪瑞敏,朱秋劲,张春花,等.不同提取方法对天麻多糖抗氧化活性的影响.食品科技,2015,40:208-211.

12 陈娟,徐海丽,甄承,等.天麻素提取工艺研究进展.广州化工,2015,43:14-15.

13 李红月,孙志伟,王淑琴.天麻素在神经系统的药理作用研究概况.中国医药,2015,35:1047-1050.

14 黄俊华,王桂莲.天麻注射液及天麻甙药理作用的初步研究.中国医学科学院学报,1985,7:399-402.

15 黄俊华,王桂莲.天麻注射液去天麻贰部分和天麻贰药理作用的比较.中国医学科学院学报,1989,11:147-150.