一种新的温度调控型原核表达载体的构建及功能研究

现代生物技术研究中，原核表达系统仍是获得目的重组蛋白及蛋白功能研究的重要手段。大肠杆菌优势明显，成为蛋白高效表达宿主的首选，大肠杆菌表达系统其核心是表达载体。启动子会直接影响重组蛋白的表达水平及其诱导方式的有效性和经济性[1]。大肠杆菌原核表达载体的启动子类型较多，如lac/tac/trc启动子、PL/PR启动子、T7启动子等，经过多年研究和改进，基本能满足单个蛋白表达的需求。但随着研究的深入和合成生物学的发展，往往需要多个蛋白有时序的共表达。目前原核表达载体的复制子大多以ColE1复制子为主，与该复制子相容的载体类型较少，尤其是PL/PR启动子类型的表达载体不常见[2]。

pBV220原核表达载体携带PL/PR启动子，是我国自主构建的一个温控型高效原核表达载体，具有条件容易控制、操作简便、高拷贝数、大容量、强启动子及强转录终止子，可在任何受体菌中诱导表达的优点而得到了广泛应用[3-5]。但pBV220的复制子是ColE1，影响了该载体的进一步应用。本研究结合pBV220启动子的特点，基于pRSFDuet-1载体构建一种新的复制子为RSF的表达载体pRSF-PL，其能与ColE1复制子质粒相容，同时将增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到该载体中进行表达研究以验证新表达载体的功能，报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

质粒pBV220和puc-EGFP由广州医科大学实验中心提供。pRSF-Duet-1质粒购自美国Novagen，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA Marker和酶连接试剂盒购自日本TaKaRa，小鼠抗EGFP单克隆抗体及小鼠GFP/EGFP-Tag单克隆抗体购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 温控型PL/PR启动子的克隆

根据载体pBV220序列，扩增其PL/PR启动子。设计引物：pRSF-Prl-fXbaI：5’-CCAGAATCT AGAGCCGATCAGCCAAACGTCTCTT-3’(划线部分为XbaI位点)；PRSF-Prl-rXhoI：5’-CAAAGAGTCT CGAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTC-3’(划线部分为XhoI位点)。PCR反应体系：premix Taq 10 μL，10 mmol/L的引物pRSF-Prl-fXbaI和pRSF-Prl-rXhoI各1 μL，pBV220载体0.5 μL，dH2O 7.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，接着95 ℃ 30 s、65 ℃ 40 s、72 ℃ 120 s，共33个循环。PCR反应得到约1 600 bp条带，将上述得到的PCR产物克隆到T载体中得到pT-PLR，经测序验证确认PL/PR启动子序列用于后续研究。

1.3 pRSF-PL表达载体的构建

根据pRSFDuet-1载体图谱，XhoI和XbaI位点间的片段中含有RSF复制子和卡那霉素抗性基因KanR。利用XhoI和XbaI双酶切处理pRSFDuet-1载体，回收约2 000 bp条带与pT-PLR载体经XhoI和XbaI双酶切后回收的PL/PR启动子片段(约1 600 bp)酶连后转化入DH5α感受态细胞，再通过卡那霉素抗性筛选出阳性菌。测序结果确认后的pRSF-PL用于后续研究。

1.4 pRSF-PL-EGFP载体的构建

pRSF-PL-EGFP表达载体菌经过夜培养，加入新鲜LB培养基30 ℃、180 r/min培养3 h至OD600为0.2～0.4时，转移到42 ℃、180 r/min诱导EGFP蛋白表达。经一系列表达时间梯度取样行SDS-PAGE检测显示，30 ℃培养过夜的pRSF-PL-EGFP表达载体菌未见明显EGFP表达，37 ℃条件下pRSF-PL-EGFP表达载体菌随时间增加EGFP蛋白表达均较低，且未有明显变化。见图5。

1.5 42 ℃诱导不同时间对EGFP表达的影响

取1 mL活化过夜菌液加入50 mL新鲜LB培养基中，于30 ℃、180 r/min培养至OD600为0.2～0.6时转移到37度摇床开始诱导表达，并分别于诱导表达前、诱导后1、2、3、4、6、16 h取样用于SDS-PAGE分析EGFP蛋白的表达。

1.6 37 ℃不同培养时间对EGFP表达的影响

将pRSF-PL-EGFP质粒转入大肠杆菌表达菌株Rossetta中表达。挑起单菌落接种相应抗性的LB培养基中30 ℃过夜，过夜菌液按照1∶50体积比接种于新鲜含相应抗性的培养基中，30 ℃条件下培养3～4 h后转移到42度摇床开始诱导表达，并分别于诱导表达前、诱导后1、2、3、4、6、16 h取样用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析EGFP蛋白的表达情况。将诱导后6、16 h样品中10～35 kD的条带，进行免疫印迹分析。

1.7 诱导前菌液浓度对EGFP表达的影响

利用引物Pcdf-Prl-fXbaI和Pcdf-Prl-rXhoI以pBV220质粒为模板扩增得到约1 600 bp大小的温控型PL/PR启动子，该启动子序列通过与XhoI和XbaI双酶切pRSFDuet-1载体得到的RSF复制子相连得到载体pRSF-PL，载体pRSF-PL的酶切鉴定见图1。测序后获得pRSF-PL表达载体质粒图谱，见图2。利用PCR扩增EGFP并通过EcoRI和BamHI酶切位点将EGFP基因克隆到pRSF-pL载体获得pRSF-PL-EGFP，其酶切鉴定图见图3，表明EGFP基因成功克隆到pRSF-PL上，该结果也得到了测序结果的验证。

2 结果

2.1 pRSF-PL和pRSF-PL-EGFP载体的构建

分别取1 mL活化过夜菌液加入4个50 mL新鲜LB培养基中，于30 ℃、180 r/min培养不同时间，使菌液OD600分别为0.2、0.3、0.6、0.7时转移到42度摇床开始诱导表达，并在诱导后6 h取样用于SDS-PAGE分析EGFP蛋白的表达。

电感耦合等离子体发射光谱法测定十全大补丸中12种微量元素含量的方法研究 ………………………… 康 璧等（5）：637

  

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注：1：XbaI/XhoI双酶切pRSF-PL产物；2、3：使用引物Pcdf-Prl-fXbaI和Pcdf-Prl-rXhoI PCR扩增pBV220的产物；M：DNA Marker DL2000

 

图1 载体pRSF-PL酶切鉴定

  

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图2 pRSF-PL表达载体质粒图谱

  

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注：1、2：EcoRI/BamHI双酶切pRSF-PL-EGFP产物；M2：DNA Marker DL5000

图3 pRSF-PL-EGFP酶切鉴定

2.2 42 ℃诱导不同时间对EGFP表达的影响

pRSF-PL-EGFP表达载体菌经过夜培养，加入新鲜LB培养基30 ℃、180 r/min培养3 h至OD600为0.2～0.4时，转移到42 ℃、180 r/min诱导EGFP蛋白表达。经一系列表达时间梯度取样分析显示，42 ℃诱导6 h、16 h取样，肉眼可见绿色蛋白，经SDS-PAGE及免疫印迹证实该绿色蛋白为EGFP蛋白。免疫印迹显示，以30 ℃培养菌液为对照，未见明显的EGFP蛋白表达；42 ℃诱导表达后，EGFP蛋白的表达量随诱导时间延长而增加，诱导后4 h后其EGFP蛋白表达量明显增加，16 h后表达量最高。见图4。

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注：A ：SDS-PAGE检测；1：诱导前；2～7分别为诱导后1、2、3、4、6、16 h；M：P0068 180 kD Protein Marker；B：免疫印迹检测42℃诱导表达后10～35 kD蛋白；1：30 ℃培养菌液；2：诱导后6 h，3：诱导后16 h

图4 pRSF-LR-EGFP 表达载体菌42 ℃下诱导不同时间对EGFP蛋白表达的影响

2.3 37 ℃培养不同时间对EGFP表达的影响

puc-EGFP质粒含有EGFP基因。为扩增EGFP基因设计引物：PlrEGFP-EcoR-F：5’-ATGGTGAGCA AGGGCGAGGAG-3’，PLrEGFP-BamH-R：5’-TTA ACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’。PCR反应体系：premix Taq 10 μL，10 mmol/L的引物PlrEGFP-EcoR-F和PLrEGFP-BamH-R各1 μL，pBV220载体0.5 μL，dH2O 7.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，接着95 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 120 s，共33个循环。PCR扩增得到约730 bp条带。通过EcoRI/BamHI酶切后的PCR产物分别与同样酶切处理的pRSF-PL质粒酶连后转化入DH5α感受态细胞。筛选得到的阳性克隆经测序确认，得到载体pRSF-PL-EGFP。

  

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注：1：30 ℃过夜菌液；2～7分别为诱导后1、2、3、4、6、16 h；M：P0068 180 kD Protein Marker

图5 pRSF-LR-EGFP 表达菌37 ℃诱导不同时间对EGFP蛋白表达的影响(SDS-PAGE)

2.4 诱导前菌液浓度对EGFP蛋白表达的影响

多个pRSF-PL-EGFP表达载体菌经过夜培养，30 ℃培养不同时间至OD600分别为0.2、0.3、0.6、0.8时，42 ℃诱导表达EGFP蛋白并在诱导后6 h取样用于SDS-PAGE分析，结果显示菌液浓度低时EGFP蛋白在诱导后6 h表达量比较高，但OD600超过0.6时EGFP蛋白在诱导后6 h表达量反而降低。见图6。

  

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注：1～4分别为OD600=0.2、0.3、0.6、0.8；M：P0068 180 kD Protein Marker

图6 过夜菌液加入新鲜培养基中培养至不同浓度下42 ℃诱导EGFP的表达

3 讨论

一个良好的高效表达外源蛋白的表达载体，除了必须的复制子、筛选标记和方便克隆的多克隆位点外，还能对外源基因表达严密调控，非诱导状态外源蛋白表达水平低，而诱导时能产生大量外源蛋白[7]。PL启动子是通过温敏型阻遏蛋白，也就是大肠杆菌入噬菌体的基因产物cIts857，调控其转录活性。低温时阻遏蛋白cIts857较稳定，温度提高则会影响其稳定性进而增加PL启动子活性及其调控下蛋白的表达[8]。本研究为验证pRSF-pL载体功能，将EGFP基因克隆到该载体中构建pRSF-PL-EGFP并对其表达EGFP进行检测，结果显示在30 ℃或37 ℃条件下EGFP蛋白的表达都比较低，而42 ℃条件下培养表达菌株宿主时EGFP蛋白在诱导后4 h开始大量表达。这表明新载体pRSF-PL具有与pBV220载体一样的优点，是一个严密调控型表达载体。

pBV220原核表达载体是我国自主构建的一个优秀原核表达载体，利用PL/PR启动子，通过温度调节来控制外源蛋白的高效表达[6]。由于PL/PR启动子的特点，该表达载体对宿主菌限制少，调控外源基因的表达也比较经济和简单。但该载体的复制子ColE1不能与同类型复制子的载体在同一宿主中实现共表达，这限制了该载体的进一步应用。本组在构建重组MS2噬菌体的研究中，需要对多个蛋白同时进行温度调控下的原核表达，而现有温控型表达载体并不能满足要求。利用pBV220和本研究构建的新载体pRSF-pL可以较好地解决MS2噬菌体衣壳蛋白及被其包装的RNA的转录和表达问题，也验证了载体pRSF-pL能与ColE1复制子质粒pBV220相容，在同一宿主中实现多个蛋白的共表达。

鱼鳖混养需要投入鳖苗和混养鱼类苗种。在投入各种苗种前，需要建造必要的养殖生产设施，便于日常的养殖管理。主要设施包括：吊网捕鱼操作系统、防逃设施、食台与晒背平台、水库浅水区人工鱼巢的设置等。

宿主菌的生长情况与培养条件是密切相关的，二者对外源基因的表达也有一定影响[9]。我们实验结果显示pRSF-pL在表达EGFP蛋白时，在宿主菌的菌液浓度低时诱导EGFP表达量比较大，诱导前宿主菌菌液浓度过高会降低目的蛋白的表达量；从诱导时间来看，诱导后4 h目的蛋白才显著增加，诱导表达16 h蛋白量更高。

综上述，我们认为本研究构建的新载体pRSF-pL是一个温度调控的严密调控型的高效表达载体；利用pRSF-pL表达外源蛋白时，将表达宿主菌株扩大培养至OD600为0.2～0.6、诱导时间超过4 h为好。

2.1 确立项目 在项目学习中，第一步是要确定项目(课题)。“二考”复习中项目的确定应该根据课程标准、《浙江省普通高中学科教学指导意见·生物》和《浙江省普通高中学业水平考试暨高考选考科目考试标准(2014版)》，以及教学内容和学生已有的知识及经验。项目可以是环境保护、人体健康等方面密切相关的社会性议题，也可以是学生身边需要解决的生活和生产实践问题。在确定项目时，该项目是否包含了生物学主干知识，是否涵盖了学科核心素养，是否贴近学生的生活，是否来源于社会生产实践，是否真实且有意义，学生是否感兴趣，是否具有可操作性等，都是需要考虑的问题(图1)。

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参考文献

[1] 王宏伟，金宁一，龚伟，等.温控表达载体的构建及HIV-1 p24的表达与纯化[J].武汉大学学报(自然科学版)，1999，45(4)：505-508.

[2] 蒋钰瑶，何嘉荣，王未未，等.新型大肠杆菌高效表达载体pHsh的构建与应用[J].微生物学通报，2012，39(3)：394-400.

[3] 戎晶晶，刁振宇，周国华.大肠杆菌表达系统的研究进展[J].药物生物技术，2005，12(6)：416-420.

[4] 朱大兴，王艳萍，杨学勤，等.高效原核表达载体pBV220的改造与应用[J].生物工程学报，2008，24(7)：1312-1316.

[5] 张智清，姚立红，侯云德.含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用[J].病毒学报，1990，6(2)：111-116.

[6] 齐义鹏.基因及其操作原理[M].武汉：武汉大学出版社，1998：333-334.

[7] 田秋丰，于申业，衣菲，等.基于单核细胞增生李斯特菌prfA基因新型原核温控表达载体的构建[J].中国预防兽医学报，2014，36(9)：688-691.

[8] 李伯良，江智红.clts857基因的克隆、修饰及温敏诱导表达载体[J].生物化学与生物物理学报，1994，26(4)：389-396.

[9] 隋广超，胡美浩.影响大肠杆菌中外源基因表达的因素[J].生物化学与生物物理进展，1994，21(2)：128-132.