大豆异黄酮延缓脐静脉内皮细胞衰老的机制研究

随着人口老龄化趋势的加剧，老年性疾病特别是动脉硬化性心血管疾病与日剧增，成为威胁老年人健康的首要疾病，给国家和社会带来沉重负担。有研究显示，雌激素在延缓衰老，减少动脉粥样硬化过程中发挥着重要的作用[1-2]。但现有的雌激素会增加深静脉栓塞和肺栓塞的风险及心血管事件发生率[3-4]。因此，研究副作用较小的雌激素选择剂成为目前研究的热点。大豆异黄酮是一种天然雌激素，结构和功能上与雌二醇高度相似，可与雌激素受体结合，表现弱雌激素作用，具有心血管疾病保护作用，特别是其抗氧化功能逐渐成为研究的热点[5-7]。本研究通过H2O2诱导建立衰老细胞模型，探讨大豆异黄酮对衰老的血管内皮细胞作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大豆异黄酮溶于无水乙醇，配成10 μmol/L溶液；ICI182780溶液用培养液稀释，作用浓度为10 μmol/L，并使溶液中乙醇及BMSO终浓度<0.1%。

1.2 细胞培养及分组

原代培养的人脐静脉内皮细胞购于美国Sciencell公司。于37°C,5%CO2条件下培养，取第3～5代细胞备用，细胞贴壁达到80%后进行试验。

实验分组：(1)对照组；(2)H2O2组：100 μmol/L H2O2的完全培养液作用细胞24 h；(3)大豆异黄酮组：在H2O2组基础上，在H2O2刺激前1 h先用10 μmol/L大豆异黄酮干预。(4)抑制剂干预组：在大豆异黄酮组基础上，在大豆异黄酮干预前1 h先用10 μmol/L的ICI182780干预。

1.3 SA-β-半乳糖苷酶染色

弃细胞培养液，用PBS漂洗2～3次，用4%多聚甲醛和0.2%戊二醛4°C固定10min后吸出固定液，PBS洗涤细胞3次，每次约10分钟。加入ABC，x-gal混合液，37°无CO2孵育过夜。普通光镜下计数胞浆蓝染细胞数目，每种细胞计数4个视野，每个视野至少100个细胞，计算细胞染色阳性率。

生态旅游促使了区域传统旅游形式向自然、社会和经济协同发展转变，这种重生态性、亲自然性和软文化性的旅游模式日益受到广大游客的青睐，已然成为一种全新的旅游选择取向，成为当代旅游市场中一个极为重要的增长极。中俄界江地区是指沿黑龙江与乌苏里江向两侧延伸，以当壁镇—龙王庙一线为分界，南北各属中国与俄罗斯的总面积4 380 km2多的广袤地带。该区域在地理位置上位于我国疆土的最北端与最东端，同时与俄罗斯的三大州和两大区接壤，地理位置极为重要。全面分析界江地区丰富的生态旅游资源及其分布表征是其发展生态旅游的先决条件。

1.4 细胞内活性氧(ROS)的检测

与对照组比较，H2O2组衰老指标P-Rb减少，加入10 μmol/L大豆异黄酮作用后，P-Rb增加(P<0.05)。加入ICI182780后，大豆异黄酮抗衰老作用受到抑制(P<0.05)。见图2。

1.5 MDA、SOD、 NO、ET-1 水平检测

加入蛋白裂解液，离心，提取总蛋白。将每个样本等量进行电泳、切胶，电转移，然后转膜，封闭，并依次孵育一抗和二抗，ECL显影分析 pRb蛋白的表达情况。

（2）降低了运行成本。改造后，行车仅做检修用，行车电耗减少了；使用洗水去洗涤带式过滤机滤布既可节约用水，也可防止系统内水量膨胀；碱液喷淋淋洗工艺按气量130000Nm3/h、酸雾初始浓度400mg/m3、排放浓度浓度40mg/m3，年消耗NaOH （100%）300t，约为 96 万元。电除雾工艺按同等含酸雾废气条件，电除雾捕收酸雾产生的废酸按全部采用石灰中和方式处理，年需消耗石灰433t，费用约为15万元。综合比较，电除雾工艺每年运行费用要较碱液喷淋淋洗工艺节约80万元。

1.6 Wester blot法测定P-Rb蛋白表达水平

收集各组上清液100μL，分别测定MDA、SOD、 NO、ET-1 水平。MDA 含量测定用硫代巴比妥酸法测定，NO含量测定用 Griess 法测定，ET-1含量用放射免疫法测定，步骤分别参照试剂盒说明书。

1.7 统计学分析

1)斜面长度3 mm；2)针尖倒角(17±2)°；3)针尖曲率半径(2.5±0.5) μm。XLPE水树老化样本如图1所示。

2 结果

2.1 SA-β-半乳糖苷酶染色阳性率及细胞活性比较

衰老是由环境和遗传等多种因素导致器官功能的衰竭。研究证实，氧化应激所致的衰老在动脉粥样硬化性疾病中发挥着重要的角色。衰老是不可抗拒的，但减少氧化应激可以延缓衰老的进程，这对于减少衰老性心血管疾病有着重要的意义。近年来，大量研究结果提示，植物雌激素能有效降低动脉粥样硬化性疾病[8]。大豆异黄酮是天然的雌激素替代品。已有研究证实大豆异黄酮在女性心血管疾病的发病和预防治疗中起重要作用[9]。本研究目的在于探讨大豆异黄酮能否延缓脐静脉内皮细胞的衰老及其可能的作用机制，以为大豆异黄酮防治老年性动脉粥样硬化性疾病提供一定的实验依据。

与对照组细胞相比，H2O2组阳性细胞活力下降。与H2O2组相比，给予10 μmol/L 大豆异黄酮预处理组后，细胞活性增加；加入ICI182780抑制剂后，细胞活力受抑制(P<0.001)。见图1d。

2.2 大豆异黄酮对MDA及SOD的影响

与对照组比较，H2O2组内皮细胞MDA升高，SOD降低(P<0.05)。加入大豆异黄酮后，MDA降低及SOD升高(P<0.05)。加入雌激素受体抑制剂后，这种细胞保护作用受到抑制(P<0.05)。见表1。

2.3 大豆异黄酮对NO,ET-1含量的影响

1.1 研究对象 纳入 2018年1月至 6月在海军军医大学（第二军医大学）长海医院心血管内科行冠状动脉造影检查的老年患者 345例。纳入标准：住院患者，年龄≥60 岁，性别不限，接受冠状动脉造影术检查；排除标准：1 个月内曾服用肾毒性药物，碘过敏，肾动脉狭窄，休克，急性肾功能衰竭，血液透析，恶性肿瘤，配合度差，冠状动脉造影证实为扩张性心肌病、肥厚性心肌病等疾病，以及临床资料不全的患者。本研究已通过海军军医大学（第二军医大学）长海医院医学伦理委员会审批。

  

AB100806040200150100500细胞活力(%)SA-β糖苷酶染色CD12341234*#Δ*#Δ

1.对照组；2.过氧化氢组；3.大豆异黄酮组；4.抑制剂组

A.SA-βgal化学正常细胞(×200) ；B.SA-βgal化学染色阳性细胞(×200)；C.不同组细胞糖苷酶染色；D.不同组细胞活力

注：与对照组比较，*P<0.05；与过氧化氢组比较，#P<0.05;与大豆异黄酮组比较，ΔP<0.05

 

图1 SA-β-gal阳性细胞化学检测及细胞活力检测结果

 

表1 各组内皮细胞中MDA、SOD含量比较

  

组别MDA(nmol/L)SOD(NU/mL)对照组4.35±0.1734.45±2.21H2O2组5.62±0.08∗12.56±1.01∗大豆异黄酮组4.07±0.04#30.37±3.08#抑制剂组5.37±0.13△14.36±1.32△

注：与对照组比较，*P<0.05；与H2O2组比较，#P<0.05；与大豆异黄酮组比较，△P<0.05。

 

表2 各组内皮细胞中NO、ET-1含量比较

  

组别NO(μmol/L)ET-1(μg/L)对照组13.89±1.350.28±0.04H2O2组6.89±0.85∗0.69±0.06∗大豆异黄酮组13.74±1.2#0.38±0.03#抑制剂组7.37±0.63△0.58±0.03△

注：与对照组比较，*P<0.05；与H2O2组比较，#P<0.05；与大豆异黄酮组比较，△P<0.05。

2.4 不同组别衰老相关蛋白P-Rb的表达

用 DCFH-DA探针检测ROS。本身没有荧光的DCFH-DA可穿过细胞膜进入细胞,在胞内转化生成DCFH 。在ROS存在的条件下,DCFH被氧化生成荧光物质 DCF ,绿色荧光强度与细胞内ROS水平成正比,在激发波长502 nm,发射波长530 nm附近,用荧光酶标仪检测DCF荧光，从而测定细胞内ROS水平。

  

p-Rbβ-actin---+--++-+++过氧化氢(10μm)大豆异黄酮(10μm)ICI182780(10μm)2.01.51.00.50.0*#△1234p-Rb的相对密度

1.对照组；2.过氧化氢组；3.大豆异黄酮组；4.抑制剂组

注：与对照组比较，*P<0.001；与H2O2组比较，#P<0.001；与大豆异黄酮组比较，△P<0.05。

图2 各组衰老相关蛋白P-Rb的表达

3 讨 论

与对照组相比，H2O2组阳性细胞率增多。与H2O2组相比，10 μmol/L 大豆异黄酮预处理组阳性细胞率降低；与10 μmol/L大豆异黄酮组预处理组相比，ICI182780+大豆异黄酮预处理组，阳性细胞率增多(P<0.001)，说明ICI182780能阻断大豆异黄酮的抗衰老作用。见图1A～1C。

应用SPSS19.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间多重比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

本研究结果显示，内皮细胞受到H2O2氧化刺激后，ROS增多，细胞活性降低，细胞衰老明显，主要表现为受到氧化应激后，线粒体受到破外，ROS生成增多，其过量堆积会造成膜脂质过氧化反应，引起细胞膜等结构破坏，导致细胞氧化损伤。细胞修复机制出现障碍，机体在组织细胞水平上表现为DNA破外，蛋白质折叠，细胞器受损，有害物质大量蓄积，进而引起细胞周期停滞，使得细胞衰老程度加重，加速细胞的死亡[10]。

与对照组比较，H2O2组内皮细胞ET-1生成增多，NO合成减少(P<0.05)。加入大豆异黄酮后，ET-1生成减少及NO升高(P<0.05)。 加入雌激素受体抑制剂后，这种细胞保护作用受到抑制(P<0.05)。见表2。

MDA 是自由基对不饱和脂肪酸引发的脂质过氧化物的最终产物，SOD 活性反应细胞清除氧自由基的能力。本研究结果显示，氧化应激过程中，与对照组比较，H2O2组SOD减少，MDA增多。可能是氧化应激反应导致细胞内氧自由基增多，细胞抗氧化能力不足，氧化抗氧化失衡，氧化抗氧化系统的异常。如果细胞损伤不能及时修复，则会加速了衰老的进程。

(3)烧结硬度随着其致密度的上升而提高，在FeCrBSi添加量为3%时达到最大值75 HRB，而高于5%时由于晶粒长大变粗，硬度呈下降趋势．

本研究还显示，在氧化应激过程中，ET-1增多，NO生成减少。这提示在氧化过程中发生内皮功能损伤。内皮功能是血管的保护屏障。当血管内皮受到氧化应激时，内皮细胞的屏障受损，以旁分泌或自分泌形式分泌ET-1及NO等多种活性物质，促进ET-T生成，NO-1合成减少，ET-1/NO比例失调，进而引起血管的舒张收缩功能异常，内皮功能障碍。

既往研究证实，雌激素能保护内皮细胞，延缓衰老作用[7-8]。但长期服用雌激素会引起脑卒中，诱发乳腺癌等，其应用受到很大限制。新近研究表明，大豆异黄酮是一种新的植物雌激素，具有类雌激素样作用。我们推测它可能与雌激素一样，能对抗氧化应激，延缓内皮细胞衰老。本研究结果显示，大豆异黄酮干预衰老脐静脉内皮细胞后，细胞产生的ROS减少，细胞糖苷酶染色阳性率降低，衰老相关蛋白P-Rb表达量减少，ET-1及MDA增多，NO及SOD 生成减少。这提示大豆异黄酮能对抗内皮细胞的氧化和衰老。当加入雌激素受体抑制剂后，大豆异黄酮的抗衰老作用受到抑制，提示大豆异黄酮可能通过上调血管雌激素受体的表达，减少活性氧的蓄积，从而延缓血管衰老的发生。

需要注意的是，本研究尚限于细胞及蛋白的水平研究，存在一定的局限性，还有待于进行更多的基础、临床试验予以进一步证实。

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