非小细胞肺癌中E-钙黏蛋白、β-连环蛋白、基质金属蛋白酶9的表达与循环肿瘤细胞的关系及其对预后的影响

肺癌是一种常见恶性肿瘤，在我国呈现出高发病率和高死亡率的临床和流行病学特征，严重威胁居民健康并造成严重的社会经济负担。研究表明我国肺癌发病率以年平均1.62%的增长率逐年上升[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的比例超过85%，初次确诊时大多已处于晚期，失去手术机会且放化疗效果欠佳，其原因与肿瘤的侵袭和转移密切相关。抑制肿瘤生长、阻断肿瘤转移是恶性肿瘤研究和治疗的关键。目前已被证实在NSCLC等多种肿瘤中，上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤细胞的侵袭、迁移、转移和药物耐药过程中起到关键作用，表现为EMT相关的E-钙黏蛋白(E-cadherin)、β-连环蛋白(β-catenin)异常表达及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)所介导的细胞外基质(ECM)水解过程有关[2-4]。研究表明循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)以不同形态存在于外周血中，既有游离的单个CTC，也有聚集成团的细胞团，肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中会发生EMT，故CTC检测阳性提示肿瘤已有微转移发生[5]。目前结合NSCLC上述蛋白表达及肿瘤组织病理特点分析患者预后的研究不多，本研究拟检测NSCLC病理组织E-cadherin、β-catenin、MMP-9和CTC表达，分析其与临床病理的相关性，探讨综合多项指标判断NSCLC预后的意义。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。计数资料以例(百分率)表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源及一般资料

选用2011年6月至2012年6月我院经胸外科手术切除并经病理确诊的NSCLC石蜡包埋标本86例，其中男59例、女27例。年龄36～77岁，平均(58.0±0.5)岁。所有患者术前均未行放疗和化疗。其中鳞癌45例、腺癌36例、大细胞癌5例。肿瘤分级为低分化46例、中分化16例、高分化24例。有淋巴结转移45例、无淋巴结转移41例。其中34例患者有完整的随访资料，生存期≤5年者28例、5年以上者6例。所有病例的病历资料均详细记录患者年龄、性别、瘤体大小、病理类型、肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况等。另选取同期28例肺部良性病变组织石蜡包埋标本作为对照。

1.2 实验方法

采用免疫组化(SP法)染色检测肺组织标本E-cadherin、β-catenin的表达。鼠抗人β-catenin单克隆抗体SC-7963、E-cadherin单克隆抗体ZM-0092均购自福州迈新生物技术开发有限公司，鼠抗人MMP-9单克隆抗体购自美国R&D公司。用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照。

本文的研究对象是投资组合理论本身，研究目的是用数学工具证明投资组合理论发散系统性风险这一基本思想的正确性，通过投资组合的单调非增次模集函数证明了该理论的正确性，并通过标准差构造的方程二次验证理论的正确性.详见图1.

采用SPSS 13.0软件分析处理数据。计量资料采用表示，组间比较采用t检验；分类变量组间比较采用c2检验。多因素Cox回归分析影响预后的危险因素。采用双侧检验，检验标准取0.05。

1.3 结果判定

本研究发现，E-cadherin、β-catenin在NSCLC中阳性表达率分别为57.9%、67.4%，而在肺良性病变组织中未见表达，差异均有统计学意义(均P<0.05)；NSCIC中β-catenin的表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移以及TNM分期有关，肿瘤分化程度高、无淋巴结转移、分期早时E-cadherin和β-catenin高表达，反之则低表达，与文献报道一致[19]，提示E-cadherin和β-catenin与肿瘤的恶性程度相关，其表达下调可引起细胞连接的丧失或减弱，使肿瘤细胞迁移能力得到提高，促进EMT发生，而EMT可促进肿瘤浸润转移[20]。本研究中MMP-9在NSCLC中过表达，阳性率为63.9%，与瘤体大小及淋巴结转移有关，且与β-catenin的异常表达显著相关，这与MMP-9参与肿瘤的侵袭和转移有关。MMP-9不仅促进新生血管形成，还能通过破坏细胞间基质和基底膜从而降解基膜和ECM，促进EMT的发生。MMP可下调E-cadherin诱发EMT的发生并增加肿瘤的侵袭转移能力。综上述，E-cadherin和β-catenin表达下调和MMP-9过表达协同作用促进EMT发生，进而促进NSCLC的浸润和转移。

1.4 统计学方法

采用免疫磁珠分选法富集胸腔积液和外周血中的CTC，通过荧光原位杂交(FISH)和免疫荧光染色CD45抗原鉴定所富集的细胞是否为CTC。

2 结果

2.1 E-cadherin、β-catenin、MMP-9和CTC表达检测

统计学分析显示β-catenin与E-cadherin胞膜异位表达呈正相关(P<0.01)。连续切片中β-catenin和MMP-9的表达区域重叠，E-cadherin、β-catenin异位表达和MMP-9过表达以及CTC阳性表达有显著相关性(P<0.05)。MMP-9过表达和CTC阳性表达显著相关(P<0.01)。E-cadherin、β-catenin异位表达与肿瘤分化程度及淋巴结转移有关(P<0.05)；MMP-9过表达与瘤体大小及淋巴结转移有关(P<0.05)；CTC阳性表达与瘤体大小及淋巴结转移有关(P<0.05)；临床早期β-catenin、MMP-9异常表达和CTC阳性表达比晚期低(P<0.05)，而在不同病理类型之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

 

表1 NSCLC和肺良性病变中病理组织E-cadherin、β-catenin、MMP-9和CTC的表达

  

病理类型E-cadherin异常表达β-catenin异常表达MMP-9阳性CTC阳性NSCLC57.9%67.4%63.9%55.8%肺部良性病变00021.4%

  

 

图1 β-catenin在腺癌细胞质的表达(sp法 ×100)

  

 

图2 β-catenin和MMP-9表达重叠区(HE染色×400)

  

图3 MMP-9在腺癌中过表达(sp法×100)

2.2 NSCLC中β-catenin、MMP-9和CTC表达相关性

86例NSCLC病理组织中E-cadherin、β-catenin和MMP-9的异常表达率分别为57.9%、67.4%和63.9%，CTC阳性率为55.8%；28例肺部良性病变的病理组织中均未见E-cadherin、β-catenin异位表达和MMP-9过表达，CTC阳性6例(21.4%)。两组病理组织中E-cadherin、β-catenin和MMP-9的异常表达率及CTC阳性率组间比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1，图1～4。

  

 

图4 CTC四倍体阳性细胞

 

表2 NSCLC中β-catenin、MMP-9表达和CTC阳性及其与临床病理参数的关系(例)

  

项目β-catenin+-MMP-9+-CTC+-病理类型 鳞癌301527182619 腺癌241225111917 大细胞癌413232肿瘤分期 早期(TNM Ⅰ/Ⅱ) 201218141418 晚期(TNM Ⅲ)381637173420肿瘤分化程度 低度351130162917 中度1069797 高度13111681014肿瘤大小 >3 cm512153194626 <3 cm77212212淋巴结转移 是396396423 否19221922635

2.3 Cox模型多因素分析

通过Cox模型多因素分析患者性别、年龄、临床分期、病理类型、淋巴结转移等指标与患者预后的关系，发现淋巴结转移、β-catenin及CTC阳性为独立预后影响因素(均P<0.05)。见表3。

 

表3 COX模型多因素分析结果

  

变量自由度回归系数标准差χ2值P值风险化淋巴结转移14.187 881.335 639.831 50.001 765.883β-catenin异常表达1-1.780 350.786 545.123 60.023 60.169CTC阳性11.438 860.635 565.125 40.023 64.216

3 讨论

EMT是上皮细胞失去其极性和细胞间连结，重组其细胞骨架，表达间质细胞标志物并显示出侵袭特性的横向分化过程[3]。EMT在胚胎发育、创伤修复与组织再生、上皮来源肿瘤的转移与侵袭过程中均发挥着重要作用。在分子水平上，EMT发生的标志物有E-cadherin表达降低、波形蛋白含量升高和神经钙黏素、β-catenin的细胞核定位[6]。E-cadherin/β-catenin复合体是介导同型细胞间黏附的连接复合体，其在维持正常上皮的极性和完整性中起重要作用，肿瘤细胞间黏附的丧失是肿瘤侵袭、转移的关键。研究表明EMT与NSCLC中表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)获得性耐药相关[7-9]，保留上皮细胞表型的EGFR野生型肿瘤细胞株对EGFR-TKI仍然敏感，而转化为间充质表型的肿瘤细胞株对EGFR-TKI产生耐药，说明EMT可能是野生型EGFR肿瘤细胞株对EGFR-TKI耐药的机制之一[10]。MMP是一组锌离子依赖的金属多肽酶超家族，几乎能降解所有生物体内的ECM成分，促进新血管形成[11]。研究发现，MMP-9在乳腺癌的转移和侵袭中发挥重要作用，可能通过降解ECM诱导EMT来实现[12]。CTC是近年来精准医学时代的研究热点，肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤的研究均提示，早期检测到CTC是肿瘤疾病预后不良的独立预测因素[13-16]。肿瘤转移通常是造成恶性肿瘤患者死亡的最主要原因，约90%恶性肿瘤患者最终因肿瘤转移而死亡，而CTC则是发生远处转移的前提，是形成远处转移灶的关键环节[17-18]。

采用双盲法，两名病理医生分别判断免疫组化结果。E-cadherin、β-catenin定位于胞膜，膜阳性细胞数>70%为正常表达；细胞质或细胞核阳性细胞数>10%为异位表达。MMP-9免疫组化染色出现胞浆呈棕黄色颗粒为阳性细胞。两组患者安静状态下收集肘正中静脉血，留取3.2 mL新鲜血液标本于ACD抗凝管中，采用免疫磁珠分选法富集胸腔积液和外周血中的CTC，在一探针信号点>2个，且无血源性白细胞表面抗原(红圈或红色片状)着色时，均可计为1个阳性细胞；当细胞有血源性白细胞表面抗原(红色圈状或片状)着色或信号点≤2个，判断为阴性细胞。

蓄水拦河闸分设主河槽拦河闸和滩地拦河闸，根据两岸台地高程，闸顶高程取1 008.2 m，工程总蓄水面积85.06万m2，蓄水量90.8万m3，水域平均蓄水深度1.1 m。主槽拦河闸长度取40 m，拦河闸高3 m，底板高程1 004 m，左岸滩地拦河闸长度取120 m，右岸滩地拦河闸长度取120m，滩地拦河闸高2m，底板高程1005m。为防止风浪淘刷，洪水冲刷，结合地形条件，对拦河闸上下游近闸的主槽岸坡和滩地岸坡进行生态护岸。在蓄水区内根据蓄水深度不同，搭配种植湿地植物和水生植物，以达到净化水质，改善水生态环境，提升景观效果的作用。

有关CTC是近年来精准医学时代的研究热点，多种恶性肿瘤的研究均提示肿瘤诊断初期检测到CTC是疾病不良预后的独立预测因素[13-16]。肿瘤转移通常是造成癌症患者死亡的最主要原因，约90%的癌症患者最终因肿瘤转移而死亡，而CTC则是发生远处转移的前提，是形成远处转移灶的关键环节。CTC可能是直接从病灶脱落进入血液的上皮特征CTC，也可能是经历EMT由原发病灶或转移灶脱落进入并生存于血液循环中的CTC。因此，EMT机制在CTC形成过程中有重要的作用，这也是大多数CTC在外周循环中会发生凋亡，只有少数CTC才能够形成转移的原因所在。本实验中E-cadherin、β-catenin异位表达与MMP-9过表达及CTC阳性表达有显著相关性。CTC从肿瘤病灶脱落至进入血液中，需经历肿瘤细胞膜E-cadherin、β-catenin表达下调导致细胞间连接减弱，同时需要MMP降解基膜和ECM，三者之间有着紧密的联系，可协同作用促进肿瘤的浸润和转移。Easwaran等[21]报道，β-catenin异常表达与NSCLC的预后差相关，这可能与细胞间黏附分子异常导致肿瘤细胞间连接松散，易于发生侵袭转移以及β-catenin和MMP-9的协同作用促进EMT发生有关。Dorsey等[13]研究提示，肿瘤诊断初期检测到CTC是疾病不良预后的独立预测因素，CTC检测阳性患者的无进展生存期和总生存期均明显短于CTC阴性患者；而在有效放化疗、激素治疗或靶向抑制剂治疗后CTC数目明显下降，提示CTC可用于监测辅助放化疗的疗效。本实验采用Cox模型多因素分析，发现β-catenin、CTC阳性表达为独立预后影响因素，因此我们认为β-catenin、CTC阳性表达可作为预测NSCLC预后的有效指标。

在本实验中，E-cadherin、β-catenin、MMP-9和CTC阳性表达之间均有相关性，细胞黏附异常和MMP过表达促进EMT发生，经历EMT由原发病灶或转移灶脱落的肿瘤细胞进入血循环形成具有上皮细胞特征的CTC，在适应自身存活和增殖的器官或组织中形成转移灶。可见E-cadherin、β-catenin、MMP-9在EMT过程和CTC的形成过程中有重要作用，它们在肿瘤发生、进展和侵袭转移中有协同作用，但具体环节还有待于进一步研究，如细胞黏附异常、MMP与CTC形成之间的关系等，了解E-cadherin、β-catenin、MMP-9和CTC在NSCLC中的表达及其预后的关系对NSCLC的诊断、治疗及预后有重要意义。

我国有一个名为中国医学知识仓库（CHKD）的数据库，医院可以借此搭建一个网络平台，建立电子阅读室。一方面实现了医院的信息化建设，另一方面也能极大的满足医院医务人员的阅读需求[5]。而且电子书籍与纸质书籍相比有一个明显的优势就是能够快速找到需要的关键知识点。这是纸质书籍的弱项，传统查阅资料方式需要对大量的相关文献进行查找，费时费力[6]。而电子书籍可以借助网络检索功能对知识点进行关键字搜索，查询起来方便快捷，这也是现代年轻人青睐于网络书籍的原因[7]。

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