CD74/MIF信号通路对Capan-2细胞神经侵袭力及HIF-1α表达的影响

胰腺癌具有高死亡率、低治愈率、低生存期等特点，其中嗜神经侵袭(perineural invasion，PNI)是其特征性的生物学行为[1]。PNI的发生发展是胰腺癌的独立预后指标[2]，目前确切机制尚不明确，该领域的研究对胰腺癌诊治有较大意义。临床研究表明，CD74基因在胰腺癌组织中差异表达，其表达水平与PNI发生密切相关，但其具体作用机制仍不清楚 [3-5]。本研究在前期构建低CD74表达人胰腺癌细胞株Capan-2细胞模型工作的基础上，进一步应用小干扰RNA(siRNA)沉默巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)基因，观察其对细胞体外PNI能力的影响并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

Capan-2细胞引自北纳创联，本研究实验室前期通过siRNA慢病毒稳定感染，构建了空白载体和CD74沉默细胞株并保存[6]。10%胎牛血清、RPMI-1640、DMEM和opti-MEM培养基(美国Gibco)，Transwell小室(美国Corning)，Matrigel胶(美国BD)，Lipofectamine 2000、Trizol试剂盒(美国Invitrogen)，RIPA裂解液(上海碧云天)。鼠抗人CD7、MIF、缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)、CX3CR1、ERK1/2、β-actin单克隆抗体及相应的羊抗鼠二抗(美国Santa Cruz)，BCA-100蛋白定量试剂盒(上海博彩生物)，ECL化学发光试剂盒(北京普利莱)。

1.2 细胞培养

实验细胞接种于含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，5% CO2、37 ℃恒温箱中培养，24～48 h更换培养基，0.25%胰酶消化后传代，选用对数生长期的细胞进行实验。

抑郁症和脑卒中之间的关系是双向的：脑卒中增加了脑卒中后抑郁的风险，而抑郁则是脑卒中独立危险因素，不仅影响其康复，还能增加脑卒中的死亡率[1]。社会心理因素如家庭和社会的支持、对躯体功能障碍的接受都会影响PSD的发生和发展。研究表明，家庭和社会支持越高，其发生PSD的几率越低[19]。因此，脑卒中患者需要更好地获得心理支持，包括信息、建议和同伴或社会支持，从而尽可能减少PSD发生，减缓其进一步发展。

1.3 实验分组及处理

以空白转染人胰腺癌Capan-2细胞为对照组，CD74-siRNA慢病毒稳定感染Capan-2细胞为实验组，分别进行细胞侵袭、体外PNI实验，并进行CD74、HIF-1α、CX3CR1等蛋白测定。Oligoengine网站软件在线设计MIF-siRNA干扰序列：5’-CTATTACGACATGAACGGG-3’，送上海捷瑞生物工程有限公司合成。两组细胞转染MIF-siRNA前更换无血清opti-MEM培养基培养2～4 h，按Lipofectamine 2000说明书分别转染细胞，转染后48 h观察CD74、MIF、ERK1/2E蛋白表达。

1.4 细胞侵袭实验

收集各组细胞使用RIPA裂解液按说明抽提总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。上样50 μg总蛋白，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，电转膜至PVDF，洗涤后封闭，加入1∶1 000稀释的鼠抗人CD74、HIF-1α、CX3CR1、MIF、ERK1/2单克隆抗体，4 ℃冰箱孵育过夜，TBST洗涤后加羊抗鼠二抗(1∶10 000稀释)，室温孵育1 h，ECL化学发光法进行曝光、显影，以β-actin为内参，使用Image J软件分析计算上述蛋白的相对表达量。

1.5 体外PNI实验

我国胰腺癌的发病率近年呈明显上升趋势，但其诊断和治疗仍非常棘手。PNI是胰腺癌最为特殊的一种转移方式，指肿瘤细胞浸润神经周间隙或穿破神经外膜进入神经束膜内，沿着束膜扩展的局部浸润、转移现象。胰腺内PNI与可手术切除胰腺癌生存期下降显著相关，是独立于肿瘤浸润深度、淋巴结转移、血管侵袭等因素之外的预后指标[4]。

1.6 蛋白表达检测

4 ℃溶解Matrigel胶，DMEM培养基稀释，按每孔50 μL加入20 ℃预冷的Transwell上室底部，37 ℃培养箱孵育3 h使Matrigel胶充分凝聚。按(1.0×104)个细胞/孔的接种密度将两组细胞接种于Transwell上室内，用RPMI-1640培养基重悬细胞至200 μL；下室加入含10% PBS的DMEM培养基600 μL，5% CO2培养箱中培养48 h。弃去上室内液，取出聚碳酸酯膜，PBS冲洗，固定液中放置10 min。0.1%结晶紫染色，显微镜下观察穿过Matrigel达滤膜下层的细胞数。200倍光学显微镜下计数10个视野的细胞数，取平均值，实验重复3次。

1.7 统计学方法

所有数据录入SPSS 19.0软件进行统计。计量资料采用表示，两样本间比较采用t检验，多组计量资料比较采用方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞侵袭能力

以β-actin为内参照，对照组和实验组细胞CD74蛋白相对表达量分别为2.777±0.037、0.095±0.012；HIF-1α蛋白相对表达量分别为0.328±0.046、0.005±0.0001；CX3CR1蛋白相对表达量分别为0.276±0.014、0.014±0.002，组间比较差异均有统计学意义(均P<0.01)。显示沉默CD74基因可明显抑制其CD74蛋白表达，HIF-1α和CX3CR1等蛋白表达量也同时下降，提示HIF-1α和CX3CR1可能参与了CD74作用通路。见图3。

胰腺癌发生PNI的机制仍未完全阐明，以往认为是因为胰腺和神经间存在低阻力间隙，当肿瘤细胞通过裂隙浸润外层神经鞘后，肿瘤微环境利于肿瘤沿神经元浸润和转移[8]。随后大量神经生长因子及其受体被发现在胰腺癌组织中表达上调，提示PNI是神经元与癌细胞间旁分泌相互趋向的结果[9]。然而基于几个经典理论的治疗方法仍未能取得重大突破，PNI的详细机制尚需进一步探讨。多个研究已发现糖蛋白分子CD74参与胰腺癌PNI，具有调节生存信号和促进侵袭功能，促进PNI并保护癌细胞逃避免疫杀伤[3-4,10]。本课题组前期对胰腺癌组织的研究也发现CD74蛋白表达与PNI密切相关，并通过慢病毒稳定感染成功建立了人胰腺癌细胞株Capan-2低CD74表达细胞模型[5-6]，为接下来阐明胰腺癌细胞的生物学行为及相关作用机制打下较好的研究基础。

  

AB

注：A：对照组；B：实验组

图1 两组细胞细胞侵袭实验

2.2 体外PNI实验

2011年5月浮选车间进行了土建施工，随后进行了浮选设备招标安装及电控系统的安装。并组织公司安监人员对浮选车间安全设施进行了预先检查，对存在的安全隐患限定整改时间，确保了浮选车间高质量建设和设备安全运行。。

  

BA

注：A：对照组；B：实验组

图2 两组细胞体外PNI实验

2.3 蛋白表达检测

对照组和实验组的穿膜细胞数分别为(139.1±9.9)个/孔、(102.5±9.0)个/孔，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，显示沉默CD74基因可显著降低Capan-2细胞的侵袭能力。见图1。

  

对照组实验组CD74HIFαCX3CR1β-actin

图3 两组细胞CD74、HIF、CX3CRA蛋白表达(免疫印迹)

2.4 沉默MIF对CD74和ERK1/2蛋白表达的影响

对照组和实验组细胞分别进行MIF-siRNA转染，免疫印迹法检测CD74、MIF、ERK1/2蛋白表达，见图4。使用Image J软件分析蛋白的相对表达量显示，MIF-siRNA不影响CD74蛋白水平表达，沉默CD74可降低MIF蛋白表达；沉默CD74或MIF，ERK1/2蛋白水平均显著低于对照组，而联合抑制MIF和CD74则可使ERK1/2蛋白表达水平降至最低(均P<0.01)，提示CD74/MIF通过ERK1/2发挥信号传递作用。见表1。

  

MIFCD74ERK1/2β-actin1234

注：1：对照组；2：对照组转染MIF-siRNA；3：实验组；4：实验组转染MIF-siRNA

图4 对照组和实验组转染MIF-siRNA对MIF、CD74、ERK1/2蛋白表达的影响(免疫印迹)

 

表1 沉默MIF、CD74对两组细胞ERK1/2蛋白表达的影响

  

项目对照组对照组+MIF-siRNA实验组实验组+MIF-siRNAP值CD740.299±0.180∗0.297±0.005∗0.028±0.001#0.030±0.004#<0.01MIF0.078±0.0040.033±0.001Δ0.058±0.0040.031±0.006Δ<0.01ERK1/20.282±0.0090.024±0.0060.135±0.0070.005±0.001<0.01

注：*、#、Δ代表两两组间比较，P>0.05

3 讨论

参照文献[7]报道的方法，Transwell上室处置方式与侵袭实验相同，下室趋化培养基中则加入浓度为25 ng/mL的鼠神经生长因子。37℃、5% CO2条件下孵育12 h，棉签将滤膜上层细胞完全去除，过滤液95%乙醇固定，苏木精染色，显微镜下观察穿过Matrigel胶达滤膜下层的细胞数。200倍光学显微镜下计数10个视野的细胞数，取平均值，实验重复3次。

1.3.1 传统方法 既往在精索腹侧纵行切开一定长度的提睾肌，并在其内上方寻找疝囊，找到疝囊后将精索与疝囊分离，若疝囊较小则将其整体分离，若疝囊较大，则予横断，远端旷置，近端高位游离至疝囊颈处，并缝扎疝囊颈，内环口视情况将其缝合缩小。

采用改良Transwell小室法测定两组细胞PNI活性，对照组的穿膜细胞数为(144.9±13.1)个/孔、实验组为(104.6±10.4)个/孔。鼠神经生长因子可增加Capan-2细胞向下室趋化的数量，而沉默CD74基因后Capan-2细胞的PNI能力受到显著抑制(P<0.01)。见图2。

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本研究通过细胞侵袭和体外PNI实验进一步证实，沉默CD74基因可显著降低Capan-2细胞侵袭和PNI能力，并降低HIF和CX3CR1等蛋白的表达。众所周知，乏血供低氧是胰腺癌的另一个突出特征[11]，HIF-1是调控缺氧应激反应的核心，是一类在缺氧条件下广泛表达于人类肿瘤细胞并介导缺氧适应性反应的重要核转录因子，在促进肿瘤细胞凋亡和增殖、侵袭和转移过程中起着极为重要的作用[12]。研究发现胰腺癌组织中HIF-1α蛋白呈高表达，且和肿瘤TNM分期、病理类型、浸润转移及预后不良密切相关，干扰HIF-1α可抑制胰腺癌PNI[13-14]。近期研究发现，HIF-1α直接与CX3CR1启动子HREs区结合，上调CX3CR1的转录，从而影响胰腺癌的PNI过程，提示CX3CR1可能是HIF-1α的一个下游靶基因[15]。趋化因子CX3CR1已经被作为重要的胰腺癌神经性细胞因子受体，其与配体CX3CL1的结合在神经元/胶质细胞串扰方面起着重要作用。

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在对免疫细胞的研究中发现，CD74可能作为MIF的受体发挥信号传导作用[8-9]；而HIF-1α的表达则受到MIF-CD74-P53通路的调控，CD74可作为MIF的膜受体，激活ERK磷酸化级联反应，促进人乳腺癌细胞株MCF-7细胞HIF-1α蛋白分泌和基因表达上调[16]；下调肾癌细胞CD74基因的表达可下调HIF-1α的水平[17]。本研究结果与之相符，而应用siRNA干扰MIF不影响CD74蛋白的表达，但均可显著降低ERK1/2蛋白，联合阻断两者使该效应最大化，证实胰腺癌中CD74同样作为MIF的膜受体发挥作用，通过激活ERK促进HIF-1α、CX3CR1等PNI相关因子的释放。

综上述，沉默CD74可能通过MIF-ERK1/2信号通路，降低HIF-1α和CX3CR1蛋白表达而抑制Capan-2细胞侵袭和PNI能力，为进一步研究胰腺癌的相关治疗方案提供了依据。

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