泛病原体芯片在小儿重症肺炎病因学诊断中的应用

肺炎是儿童常见的呼吸道感染性疾病，重症肺炎严重威胁儿童生命健康，是发展中国家5岁以下儿童死亡的主要原因[1]。小儿重症肺炎往往起病急、病情变化快、并发症多，准确的病原学诊断无疑有助于及时、有效、合理的诊治。儿童重症肺炎的病原学种类较多，如病毒、细菌、支原体、真菌等，细分种类更纷繁复杂。病原学诊断是合理治疗的基础，目前临床病原体感染的诊断方法包括细菌培养法、抗原抗体免疫法、荧光定量PCR等，由于覆盖的病原体种类较少，往往无法确诊或确诊周期较长，导致临床用药缺乏针对性。对病因不明的病例往往存在经验性治疗、治疗性诊断的问题，滥用抗生素现象也较普遍。我国自主研发的一款泛病原体EOPM(Easy Operating Pathogen Microarray)芯片，可同时检测2 000余种病毒、124个属的细菌、38个属的真菌及47个属的寄生虫，可快速、准确地找到病原体[2-3]。本文使用泛病原体EOPM芯片对5例不明原因的儿童重症肺炎进行检测，旨在探讨泛病原体芯片在不明原因的小儿重症肺炎中的诊断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年3月广东省妇幼保健院儿科收治的常规临床方法检测病原体为阴性或现有检测方法结果相矛盾的5例重症肺炎患儿为研究对象，主要临床体征及常规检查结果见表1。本研究通过了广东省妇幼保健院伦理委员会审核，所有检测、治疗均得到患儿家属的知情同意。

 

表1 5例小儿重症肺炎的临床体征、实验室检查与芯片检出结果

  

病例编号性别年龄主要临床体征常规实验室检查芯片检测样本类型检测结果1男2个月反复咳嗽1个月,加重伴气促3 d。体温38 ℃。呼吸急促,49次/分,口唇发绀,三凹征阳性,双肺呼吸音粗,闻及中湿啰音。胸部CT示支气管肺炎,右上肺部分肺不张白细胞10.0×109/L,中性粒细胞百分比48%,降钙素原1.21 ng/mL。血清学九项病原体阴性。痰液细菌、真菌培养阴性。肺泡灌洗液细菌培养阴性痰液芯片检出为呼吸道合胞病毒感染,PCR确认呼吸道合胞病毒非常明显,测序确认为合胞病毒A型2女1个月24 d咳嗽6 d、加重2 d入院。体温36.7 ℃,呼吸30次/分,呼吸对称,未见三凹征,双肺呼吸音粗,可闻及湿性啰音,心率150次/分。胸片示支气管肺炎白细胞10.8×109/L,中性粒细胞百分比39.4%,C反应蛋白(CRP)16.29 mg/L,降钙素原0.2 ng/mL。血清学九项病原体阴性。肺炎支原体抗体+结核抗体检测阴性。痰液细菌培养阴性痰液、血清芯片检出为呼吸道合胞病毒与鼻病毒共感染,血清检测阴性,测序确认为合胞病毒A型、鼻病毒C型3女6个月反复发热伴咳嗽7 d入院。中低热为主,热峰38.5 ℃为主。双肺呼吸音粗,未闻及湿啰音,未见三凹征。胸部正位片示双肺纹理增粗、模糊白细胞9.2×109/L,中性粒细胞百分比49.4%,CRP<2.50 mg/L,降钙素原0.2 ng/mL。血清学九项病原体阴性。痰液、咽拭子、血培养均为阴性。咽拭子甲型、乙型流感均为阴性。肺炎支原体+结核抗体均为阴性痰液、血清芯片检出为副流感病毒与链球菌共感染,血清检测阴性,测序确认为副流感病毒3型4男4个月反复咳嗽17 d、加重3 d入院。病程中无发热,呼吸42次/分,双肺呼吸音粗,可闻及少许湿啰音。门诊胸片示支气管肺炎白细胞12.5×109/L,中性粒细胞百分比32.5%,CRP 26.83 mg/L,降钙素原0.2 ng/mL。血清学九项病原体阴性。咽拭子细菌培养、血培养均为阴性。肺炎支原体+结核抗体均为阴性痰液芯片检出为副流感病毒感染,测序确认为副流感病毒3型5男4岁10个月发热、咳嗽3 d入院。反复高热,热峰40 ℃,精神稍差,呼吸急促,未见三凹征,双肺呼吸音粗,可闻及中等量湿啰音。胸部CT平扫+三维重建示双肺各叶段支气管管壁增厚,管周及外侧肺野可见多发斑片状、结节样及较大团片状实变影,边缘模糊白细胞6.7×109/L,核左移,血红蛋白119 g/L,CRP 52.72 mg/L。呼吸道九项病原体检测阴性。抗结核抗体阴性。肺泡灌洗液PCR-呼吸病原体6项检测阴性。咽拭子、脑脊液、肺泡灌洗液细菌培养、真菌培养均阴性肺泡灌洗液芯片检出为腺病毒感染,测序确认为腺病毒7型

注：血清学九项病原体检测采用九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒(间接免疫荧光法，西班牙VirCell)，检测病原体包括肺炎衣原体、肺炎支原体、嗜肺军团菌、Q热立克次体、流感病毒A型、流感病毒B型、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 收集本院儿科5例小儿重症肺炎留存的痰液、肺泡灌洗液、咽拭子或血清样本。

1.2.2 核酸提取 利用天根生化科技(北京)有限公司病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，按说明书提取、纯化样本中的DNA、RNA。

1.2.3 芯片检测 参照文献[2]的方法提取DNA或RNA，反转录生成cDNA、双链cDNA，行随机引物-PCR扩增。PCR反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、50 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，然后72 ℃ 5 min。PCR产物纯化后经随机引物和Klenow酶反应标记cy5荧光素，同时用没有感染症状的正常人对应类型样本做对照，并进行以上实验后标记cy3荧光素。然后cy5和cy3标记的DNA混合一起与EOPM芯片进行杂交。65 ℃杂交17 h后经过清洗，Agilent扫描仪扫描、提取数据，将芯片上探针信号值导入EOPM芯片在线判读软件(http://bioinfor.club:8080/microbial/)进行判读。

本研究中，病例1、病例2使用呼吸道九项病原体检测试剂盒检测结果皆为阴性，均未检出呼吸道合胞病毒；病例3、病例4也皆为阴性，均未检出副流感病毒；病例5未检出腺病毒。而EOPM芯片能检出显著的呼吸道合胞病毒或副流感病毒，且PCR和测序进一步得到确认。3岁以下的小儿感染病毒后，IgM抗体的应答较弱，可能是IgM抗体检测结果呈阴性的原因。

 

表2 验证PCR的引物序列

  

病毒类型 引物序列(5′→3′)扩增片段大小(bp)引物序列来源呼吸道合胞病毒F:TTTAAGTACTAATTTAGCTGGR:TAATCTATGTTAACAACCCAAG420自行设计鼻病毒F:CAAGCACTTCTGTTTCCCR:CACGGACACCCAAAGTAGT400参照文献[4]副流感病毒F:GTCAATACCAACAACTATTAGCR:TAACCAATACACCTACATGC280参照文献[5]腺病毒F:GCAGTGGTCGTACATGCACATR:CCATGTCCAGCACTCGGTTGTC266参照文献[2]链球菌F:GTACAGTTGCTTCAGGACGTATCR:ACGTTCGATTTCATCACGTTG197参照文献[6]

2 结果

2.1 芯片杂交分析

以5例患儿核酸样本为模板，PCR均扩增出特异性片段，双向测序及序列比对显示与芯片结果一致，见图2。测序比对细分型结果分别为呼吸道合胞病毒A型、鼻病毒C型、副流感病毒3型、腺病毒7型。

习作是小学语文教学中重点和难点内容。小学生受年龄限制，缺乏生活阅历，还没有形成较强的理解和观察能力，写作文经常无话可说。在小学高段作文教学中应用体验式教学，让学生在生活体验的基础上写作，能有效丰富作文内容与形式，对于提升小学语文高段作文教学质量具有重要意义。

2.2 PCR及测序验证

EOPM杂交芯片显示背景干净，红、绿、黄色清晰可见，见图1。将杂交信号导入软件进行分析，从属、种的富集度排序上选择排在前列者，并进行统计学评估。以病例1为例，芯片杂交结果分析显示排在前3位者都是呼吸道合胞病毒，高度富集，统计意义非常显著，判定为阳性结果，见表3。5例不明原因小儿重症肺炎芯片筛查结果分别是：病例1，呼吸道合胞病毒；病例2，呼吸道合胞病毒与鼻病毒共感染；病例3，副流感病毒伴随链球菌共感染；病例4，副流感病毒；病例5，腺病毒。见表1。

结果表明，模型组大鼠心肌梗死率达42.60%，丹酚酸B低、高剂量组动物的心肌梗死率分别缩小至37.21%和35.93%，与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。假手术组大鼠因未出现心肌梗死，心肌梗死率未纳入统计学比较。见图1。

  

注：红色为患者样本杂交信号，绿色为对照杂交信号。

 

图1 病例1的EOPM芯片杂交图

 

表3 病例1基于EOPM芯片杂交的病原体在种水平的富集分析

  

SpeciesmMAdjusted P-valueHuman respiratory syncytial virus63970.00E+00Respiratory syncytial virus17250.00E+00Bovine respiratory syncytial virus8406.95E-07

注：M为芯片上该病毒所设计的全部探针数目，m为本次实验中检出的阳性探针数。

  

1000700500400300200100bp病例1病例2病例2病例3病例3病例4病例5

注：病例1，呼吸道合胞病毒；病例2，呼吸道合胞病毒与鼻病毒共感染；病例3，副流感病毒伴随链球菌共感染；病例4，副流感病毒；病例5，腺病毒

图2 PCR产物电泳图

3 讨论

综观当今学者对社会福利政策质量评价的研究，总体上持有三种观点:（1）评价社会福利政策方案；（2）评价社会福利政策全过程，既包括评价政策方案，还强调对政策执行以及政策效果的评价；（3）评价社会福利政策效果。这些观点虽然视角不同，各有侧重，但最重要的共识已经达成，即社会福利政策质量评价是一种包括价值、原则、标准及方法论在内的活动过程，而不仅仅是一种纯技术性、量化性的活动。本文探讨社会福利政策质量评价倾向于第二种观点，即政策质量评价是对政策全过程的评价，既包括对政策方案的评价，也包括对政策执行以及政策效果的评价。

本研究所用的EOPM芯片的病原体覆盖范围广，能检测所有已知病毒、细菌、真菌、寄生虫等脊椎动物病原体，可为感染性疾病快速锁定病原体。芯片采用60-mer寡核酸探针，能与相似但不完全相同的序列杂交，在检测已知种属的变种上具有明显优势。由于采用随机引物扩增法进行样品制备，其较特异性PCR扩增效率低，再加上对照样本选择的是正常人对应部位样本，可消除共生微生物产生的背景信号，阳性结果往往说明患者体内某种病原体的非正常富集。此外，EOPM芯片检测判读软件操作简单、结果直观易懂，按照标准操作规程，整个病原体芯片从标本采集到结果判读时间可控制在30 h内完成。因此，当不明原因的疾病爆发时，EOPM芯片提供了一种全面、快速、有效的检测手段。

首先，当地政府部门应该积极完善现阶段的法律法规，确保每一家进入到餐饮市场的企业都处于同一市场竞争机制下，保证公平性。

1.2.4 芯片验证 对芯片检出的阳性病原体，利用种属特异性引物进行PCR扩增。扩增产物送上海铂尚生物技术公司双向测序，序列经BLAST比对确认。引物序列、片段大小及出处见表2。

儿童重症肺炎由于病情进展非常快，对患儿生命威胁大，需尽快检出致病性病原体。传统实验室病原体检测手段由于存在覆盖面狭窄，无法准确、快速确定严重感染疾病的致病体，是临床面临的一个关键问题。由于高密度芯片实验操作较简便，数据分析较简单，目前已有多款病原体高密度芯片应用于临床，确诊了多个临床不明病原体感染的病例[7-10]。

病例5呼吸道九项病原体检测试剂盒检测为阴性，利用达安基因荧光定量PCR-呼吸道病毒六项(包括巨细胞病毒、EB病毒、肺炎支原体、结核分枝杆菌、呼吸道合胞病毒、肠道病毒)检测试剂盒检测肺泡灌洗液，结果为阴性；肺泡灌洗液再使用EOPM芯片筛查，结果发现病例5为腺病毒感染，且肺泡灌洗液中的检出病毒再行PCR和测序进行了确认。腺病毒感染IgM阴性可能是小儿IgM抗体应答弱导致。EOPM芯片检测细菌的能力目前只能到属的水平，难以区分正常寄生细菌与致病细菌，这也是本平台的一个不足之处。病例3是副流感病毒与链球菌共感染，此处检出的链球菌无法确定是否为肺炎链球菌感染；本例链球菌是否参与了重症肺炎病变发展，需要结合临床综合考虑。

由于血样是临床最方便获得的样本，本研究中我们选择了病例2、病例3两例病例，收集呼吸道标本和血清标本进行芯片分析，均使用了血清样本并行对照，结果显示2例血清样本及前期实验的血清样本都无法检出阳性病原体，提示血样不是直接查找病原体的适宜样本，很多病原体并不进入血液循环。痰液或肺泡灌洗液样本都能用芯片成功检出病原菌，病变部位局部取材可明显提高检出率。

呼吸道合胞病毒是种RNA病毒，是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染最常见的病毒病原体之一，特别是2～6个月小婴儿在感染呼吸道合胞病毒后常发生严重的毛细支气管炎和肺炎[11-12]。鼻病毒感染属于肠病毒属，在婴幼儿中除上呼吸道感染外还能引起支气管炎和支气管肺炎。鼻病毒分为A、B、C三种亚型，其中C型于2004年首次在美国纽约报道，在全球范围内流行，高遗传变异性是其一个特点；C型鼻病毒不仅在儿童中的感染率更高，且与儿童感染后喘息和哮喘的关系密切[13]。副流感病毒可导致轻度至重度的上呼吸道和下呼吸道感染，它与儿童急性呼吸道感染有重要的临床相关性，因其中30%～40%的病例是由副流感病毒引起的，仅次于呼吸道合胞病毒。腺病毒肺炎约占儿童期肺炎的10%，是婴幼儿肺炎中最严重的类型之一，常见于6个月至2岁的婴幼儿，多由腺病毒3、7型引起，临床上7型多导致重症肺炎。病毒感染的检出可为合理使用抗生素、针对临床处理提供病因学的重要证据。

综上述，泛病原体EOPM芯片能有效检测出不明病因小儿重症肺炎的致病原，为针对性的临床治疗提供了重要的依据。

参考文献

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