Wnt3蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

肺癌是最常见、恶性程度最高的肿瘤之一，其中80%～85%为非小细胞肺癌。我国2015年新发肺癌及因肺癌致死例数均为各大癌症之首[1]，由于大多数患者确诊时为局部晚期或晚期，生存时间短。肺癌的发病机制复杂，是多因素、多基因、多阶段、多条信号通路共同作用的结果。Wnt信号通路在原发性肺癌的增殖、分化、转移及肿瘤干细胞自我更新等方面起着重要调整作用[2-3]。本文收集2014年1月—2016年12月南通大学附属医院手术切除的NSCLC标本64例，其中30例有癌旁组织标本。探讨Wnt3在NSCLC组织中的表达情况及临床价值。

老陈哈哈一笑，说我当过侦察兵的，别看我一把年纪了，两三个人还真的不是我的对手呢。老陈蹲了个马步，然后挥出一拳，说怎么样，这一拳，至少有几百斤的力量。然后，他又来了一个白鹤亮翅，由于脚底不稳，身体晃动了一下，我赶忙伸手搀住了他。

1 资料与方法

1.1 一般资料 64例中男性40例，女性24例；年龄34～82岁，中位年龄65岁，其中≥60岁41例，＜60岁23例；鳞癌31例，腺癌33例。按UICC肺癌分期标准（2002年修订版）进行分期，Ⅰ期29例，Ⅱ期19例，Ⅲ期16例；高分化7例，中分化42例，低分化15例；吸烟者37例，不吸烟者27例；伴有淋巴结转移者28例，无淋巴结转移者36例。所有标本为10%福尔马林固定，常规石蜡包埋的存档组织块。患者术前均未接受过化疗和放疗，均无远处转移。所有患者临床资料完整。本研究方案经南通大学附属医院伦理委员会批准，患者均签署知情书。

1.2 方法 采用免疫组化ELIVISION法，取病理科石蜡包埋组织，切成厚度为4～5 μm的薄片，经常规脱蜡至水，PBS冲洗，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶。每张切片加50 μL兔抗人Wnt3多克隆抗体（美国Abcam公司，ab32249），室温条件下孵育1小时，PBS冲洗3次，每次1 min。加50 μL抗兔聚合物（poly-HRP anti-rabbit IgG），室温下孵育30 min，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。大样本检测前，由经验丰富的病理技师操作，对多个肺癌组织切片进行免疫组化检测，经数次重复实验，选取1例Wnt3强阳性表达患者切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，再与大样本行同步检测。

1.3 结果判定 所有切片均由两位病理科医生共同观察判断。Wnt3染色结果判定：按着色细胞百分数计分，0为 0分，1%～25%为 1分，26%～50%为 2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。按着色强度计分，阳性染色的细胞条件为细胞结构清晰、阳性颗粒定位好、着色与背景对比清晰。无着色为0分，淡黄色颗粒为1分，棕黄色颗粒为2分，棕褐色颗粒为3分。将着色细胞百分数计分与着色强度计分的总和作为最终的染色分数（0～7），最终染色分数≥3分为阳性。在临床结果未知的条件下，高倍镜（400×或200×）下观察5～10个视野算出平均得分。

2.2 NSCLC组织中Wnt3蛋白的表达与临床病理特征的关系 NSCLC中Wnt3蛋白的表达与各临床病理特征之间的关系分析结果显示：Wnt3蛋白的表达与患者的性别、年龄、吸烟状态、组织学类型、侵润深度等临床病理特征之间无明显相关性（P＞0.05），而与分化程度、病理分期及淋巴结转移均有明显相关性（P＜0.05）。见表 2。

2 结 果

急诊科当中胸痛的病因比较广泛，其中部分涉及到高危致死的疾病，例如主动脉夹层、急性冠脉综合征、肺栓塞、张力性气胸等。医师要以专业的诊疗技术进行治疗，例如介入、溶栓、胸腔密闭引流等[4-5]。

  

图1 Wnt3蛋白免疫组化检测结果

 

表1 Wnt3在NSCLC及癌旁组织中的表达情况 n（%）

  

组别 例数 阳性 阴性NSCLC 64 41（64.1） 23（35.9）癌旁组织 30 12（40.0） 18(60.0)

1.4 统计学处理 应用统计学软件SPSS13.0分析资料，计数资料采用例数或率表示，Wnt3蛋白在N SCLC中的表达及与临床病理学特征的关系比较，应用四格表或行×列表的χ2检验，当理论频数小于5时，采用Fisher’s exact法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 Wnt3蛋白在NSCLC组织中的表达 Wnt3蛋白的表达主要定位于细胞浆中，随着着色强弱的不同，依次表现为棕褐、棕黄至淡黄色不等（图1）。Wnt3蛋白在NSCLC组织中的阳性表达率64.1%，高于癌旁组织中的阳性表达率40.0%，两组间比较差异有统计学意义（χ2=4.809，P＜0.05），见表 1。

Wnt信号通路是一条进化上高度保守的信号传导途径，经典的Wnt信号通路即Wnt/β-catenin信号途径研究较多。在没有Wnt信号刺激的情况下，β-catenin与GSK-3β组成的降解复合物结合，通过磷酸化，泛蛋白化等过程发生降解，使胞质βcatenin保持在较低水平[4]。TCF/LEF与抑制物结合，阻碍下游基因的表达，Wnt信号通路启动后，Wnt配体与细胞膜表面的FZ/LRP受体结合，β-catenin即从axin/APC、GSK-3β组成的降解复合物分离，在细胞内积聚并向细胞核内转移，与TCF/LEF结合[4]，从而调节下游靶基因的表达。

 

表2 NSCLC组织中Wnt3蛋白的表达与临床病理特征的关系

  

病理特征 例数 Wnt3 χ2 P阳性 阴性年龄 ≥60岁 41 27 14 0.159 0.690＜60岁 23 14 9性别 男 4026 140.0410.840女24 15 9吸烟状态 有 37 24 13 0.025 0.876无27 17 10组织类型 鳞癌 31 21 10 0.353 0.552腺癌 33 20 13分化程度 高分化 7 2 5 0.028中分化 42 26 16低分化 15 13 2淋巴结转移N0 36 18 18 7.068 0.008 N1～3 28 23 5 T分期 T1 28 17 11 0.976 T2 21 14 7 T3 11 7 4 T4 4 3 1病理分期 Ⅰ 29 11 18 0.000Ⅱ19 16 3Ⅲ16 14 2

3 讨 论

Cd元素的转移：用0.25 mol∕L盐酸将前处理的Cd样品转移至25 mL比色管中，定容摇匀，待测。

Wnt信号通路主要由信号蛋白（Wnt家族蛋白）、跨膜受体、胞浆调节蛋白、核内转录因子及其靶基因组成。Wnt家族是一类富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白，目前在人类中已发现19种Wnt蛋白家族成员。人类多种肿瘤存在Wnt家族成员异常表达，这些表达失调可能参与下Wnt信号通路的激活，从而导致肿瘤的发生、发展[5]。Wnt1是Wnt通路中第一个被发现的蛋白。Xu等[6]研究发现，手术切除的肺癌组织中Wnt1表达量明显高于癌旁组织，而Wnt1的高表达与异常的β-catenin表达及c-myc，P53等癌基因表达量升高有关，Wnt1高达者临床预后明显差于低表达者。

Katoh等[7]在对37种人类癌细胞系的研究中发现，Wnt3在A549肺癌细胞系和MNK45胃癌细胞系中的表达水平相对较高。Nakashima等[8]应用RTPCR，免疫组化方法对128例NSCLC术后标本进行Wnt3、c-myc，survivin 表达检测，并对 Ki-67 增殖指数及凋亡指数评价，结果显示Wnt3高表达的现象在NSCLC鳞癌中高于腺癌，Wnt3基因表达与cmyc、survivin基因的表达显著相关，Ki-67增值指数在Wnt3高表达的肿瘤中高于低表达者，凋亡指数在Wnt3高表达的肿瘤中低于低表达者，Wnt3高表达的肿瘤患者的总生存低于低表达的患者，多因素Cox回归分析提示Wnt3状态是NSCLC一个有意义的预后因子，该研究显示Wnt3基因表达与c-myc、survivin表达、肿瘤增值及凋亡显著相关，Wnt3过度表达促进NSCLC的病情进展。本研究采用免疫组化方法，对NSCLC患者术后标本进行Wnt3蛋白水平检测，结果显示，64例NSCLC中Wnt3阳性表达率为64.1%，30例癌旁组织 Wnt3阳性表达率为40.0%，差异有统计学意义（P＜0.05），表明 Wnt3高表达可能与NSCLC的发生发展有关。Wnt3蛋白表达与NSCLC各临床病理因素之间的关系的研究结果显示，Wnt3蛋白表达与患者的性别、年龄、吸烟状态、T分期及组织学类型等临床病理特征之间没有明显的相关性（P＞0.05），而与分化程度、病理分期及淋巴结转移均有明显相关性（P＜0.05），提示Wnt3与NSCLC的恶性程度及预后等有关。本研究检测结果中虽然Wnt3在鳞癌中表达率（21/31）高于腺癌（20/33），但差异无统计学意义，与Nakashima等[8]研究略有差异，可能与本文样本量相对较少有关，有待后续扩大样本量进一步验证。

已有研究结果提示，Wnt3蛋白通过自身分泌或旁分泌，作用于靶细胞膜特异性卷曲蛋白受体FZ，和低密度脂蛋白受体相关蛋白LRP5/6结合，激活Wnt/β-catenin信号转导通路，导致细胞质内βcatenin聚集，与FCF/LEF作用，调节靶基因表达，影响细胞的增殖、分化[9]。Wnt3影响NSCLC发生、发展的机制及其与临床病理特征的相关性有待进一步探讨，Wnt3有望成为NSCLC潜在的诊断、病情检测及判断预后的因子。

由图1可以看出，2010-2016年河南省旅游经济联系网络空间结构不均衡，总体呈现出中西部网络相对密集、东部网络相对稀疏的格局。其中2010-2013年网络结构变化较为显著，由不闭合结构发展为全闭合结构，旅游经济网络结构逐渐复杂化。此外近7年间，各城市间的旅游经济联系均有所增强，其中漯河、驻马店和信阳与其他城市的联系明显增强，由仅与郑州的单线联系发展为多城联系。在核心节点上，以郑州为单一核心的局面逐渐被打破，最终形成以郑州、洛阳、开封为核心的三足鼎立之势，河南省旅游经济联系网络正在向多核心、高密度发展。

Wnt/β-catenin信号通路可能存在多种可用于治疗肺癌的靶点，Rubin等[10]研究发现重组WIF-1能抑制肺癌的生长和骨肉瘤肺转移的发生，而Huang等[11]通过单克隆抗体下调Wnt2表达后，发现肺癌细胞的生长、转移能力受到抑制，细胞凋亡增加。因此探索Wnt通路的信号调控的分子靶点可能为晚期NSCLC治疗带来新的希望。

[参考文献]

[1]Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015［J］.CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.

[2]Anastas JN，Moon RT.WNT signalling pathways as therapeutic targets in cancer［J］.Nat Rev Cancer，2013，13（1）：11-26.

[3]Stewart DJ.Wnt signaling pathway in non-small cell lung cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2014，106（1）：356.

[4]Xu HT，Wei Q，Liu Y，et al.Overexpression of axin downregulates TCF-4 and inhibits the development of lung cancer［J］.Ann Surg Oncol，2007，14（11）：3251-3259.

[5]Duchartre Y，Kim YM，Kahn M.The Wnt signating pathway in cancer［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2016，99：141-149.

[6]Xu X，Sun PL，Li JZ，et al.Aberiant wut1/β-catenin expression is an indepandent poor prognostic market of non-small cell lung cancer after surgery［J］.J Thorac Oncol，2011，6（4）：716-724.

[7]Katoh M.Molecular clonging and characterization of human wNT3［J］.Int J Oncol，2001，19（5）：977-982.

[8]Nakashima N，Liu DG，Huang CL，et al.Wnt3 gene expression promotes tumor progression in non-small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2012，76（2）：228-234.

[9]Kato S，HayakawaY，Sakurai H，et al.Mesenclymal-transitioned cancer cell instigate the invasion of epithelial cancer cells throngh secretion of WNT3 and WNT5B［J］.Cancer Sci，2014，105（3）：281-289.

[10]Rubin EM，Guo Y，Tu K，et al.Wnt inhibitory factor1 decreases tumoringenesis and metastasis in osteosarcoma［J］.Mol Cancer Ther，2010，9（3）：731-741.

[11]Huang C，Ma R，Xu Y，et al.Wnt2 promotes non-small cell lung cancer progression by activating WNT/β-catenin pathway［J］.Am J Cancer Res，2015，5（3）：1032-1046.