牙髓干细胞及其外泌体的应用新进展*

干细胞（stem cell）是一类未分化的具有多向分化潜能和自我复制能力的原始未分化细胞，根据其来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。近年来干细胞在再生医学领域中扮演越来越重要的角色，干细胞通过增殖、分化，可以修复、再生受损或缺失的组织器官。2000年Gronthos通过酶消化法从人的第三磨牙牙髓中分离、培养得到具有克隆能力并快速增殖的牙髓干细胞，将其命名为牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）[1]。牙髓间充质干细胞（DPMSCS）以其自我更新、可塑性和多潜能的高增殖潜力而著称[2]。牙髓干细胞可以多向分化为成牙本质细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，且易于获得。因此，牙髓干细胞应用广泛，在一些方面比骨髓干细胞、胚胎干细胞等更具优势。本文就牙髓干细胞的研究新进展做一综述。

1 牙髓干细胞的生物学性状

牙髓干细胞是从正常的人类牙髓中分离的有功能的干细胞，大多数细胞呈长梭形，体积较小。DPSC是神经嵴来源的间充质干细胞[3]，具有多向分化、自我更新的能力，且能够长期低温保存。牙髓干细胞增殖能力非常强，其体外增殖率高于骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cell，BMSC）[1]。免疫组织化学方法发现牙髓干细胞表达多能标记物Oct-4、Lin-28、Sox-2和Nanog，可依据中胚层标记物Stro-1和CD146来鉴定[4]，在体外一定条件下可以形成矿化结节，在不同的培养环境下可以分化为多种细胞。

2 牙髓干细胞的应用

2.1 在牙髓、牙本质再生中的应用 龋齿和牙髓炎引起的牙髓脱落，可导致牙齿脱落和生活质量下降，目前利用牙髓干细胞进行生物再生治疗取得不错的进展。Iohara等[5]在成人牙齿行牙髓切断术后，将牙髓干细胞及基质细胞来源的因子1移植到根管中，14天后根管内形成神经、血管在内的牙髓组织，表明干细胞治疗可以保存和保护牙齿。Gronthos等[1]将DPSC结合HA/TCP（羟基磷灰石/磷酸三钙）粉末后植入裸鼠皮下，术后6周在HA/TCP微粒表面形成牙本质样结构，形成的牙本质细胞表达牙本质涎蛋白、牙本质磷蛋白等。Nakashima等[6]通过电穿孔介导的基因传递技术，将生长/分化因子11（GDF11）导入DPSC中，诱导DPSC分化为成牙本质细胞，表达成牙本质细胞标记物牙本质涎蛋白（Dsp），体内实验中可形成修复性牙本质。

随着高职院校招生规模的不断扩大，班级规模也不断扩大，多保持在40-50人左右。在这样的班级上课，因学生个性差异、学习能力、知识水平等方面的差异较大，任课教师难以因材施教面面俱到地照顾到每位学生的课堂学习。从而，教师也就难以针对不同学生的差异情况，采取有针对性的教学方法和辅导方法，使得课堂教学效果较差，无法满足学生的个性化需求。

2.2 修复牙槽骨缺损 最近的临床试验表明，DPSC能够明显促进牙槽骨缺损的修复，可以给颌面骨缺损修复或是种植骨量不足的患者提供一种生物再生治疗的选择[2]。骨组织再生工程由三部分组成，包括种子细胞，三维支架以及成骨分化因子。在αMEM培养基中添加10%胎牛血清，1%P/S，10 nmol/L地塞米松，10 mmol/L甘油磷酸酯和100 μmol/L抗坏血酸磷酸盐，即成骨诱导培养基（OM），DPSC在OM中成骨分化[7]。DPSC表达成骨标记物包括骨涎蛋白（BSP）、碱性磷酸酶（ALP）、牙本质涎蛋白（DSP）以及骨钙素（OCN）等[8]。Fujii等[7]利用细胞薄片技术（cell-sheet technology），将DPSC薄片移植入颅盖骨缺陷的小鼠模型中，观察到骨再生。细胞薄片技术无需使用支架，为DPSC移植再生提供安全性和方便性。

2.6 肌肉组织再生 一些肌萎缩、肌营养不良患者需要种子细胞进行再生修复。Yang等[21]证实DPSC可产生肌源分化，改善肌营养不良症状，表明DPSC治疗肌肉再生的潜力。2017年有报道，DPSC通过血流重建、旁分泌信号作用；直接供应的方式，对营养不良的骨骼肌有积极影响[22]。Song等[23]将DPSC暴露于添加有TGF-β1的适宜膀胱平滑肌细胞生长的微环境中，14天后平滑肌细胞特异性标志物α-SMA、结蛋白、钙调蛋白表达升高。Pisciotta等[24]研究发现，DPSC移植到mdx/SCID小鼠肌肉中，可通过旁分泌效应促进血管生成并减少纤维化，改善营养不良肌肉的组织病理学，并可能减轻假肥大性肌营养不良患者的肌肉无力。DPSC在一定条件下能够分化为肌腱系细胞，在DPSCs-PGA复合支架材料上，在力学刺激的条件下，在裸鼠背部可形成肌腱样组织[25]。

2.3 修复神经组织 DPSC具有亲神经性质，能够治疗很多神经疾患[2]。DPSC由于其自身的神经特性，可用于周围神经再生[2]。Ullah等[9]将分离的DPSC以及DPSC分化的神经细胞分别置于纤维蛋白支架和胶原蛋白神经套管，后植入坐骨神经切断的大鼠模型中，12周后发现处理组均有明显的行为活动和肌肉收缩力。免疫组织化学分析显示，处理组有血管生成、表达轴突纤维和髓鞘的特异性标记。DPSC是神经再生的一个极好的干细胞来源，可以表现出足够的外周神经再生潜力。Nicola等[10]在脊髓损伤Wistar鼠模型中，DPSC移植后配合跑步机训练，可降低TNF-α水平，保护神经。Zhang等[11]实验表明，与壳聚糖结合，DPSC产生的神经分化能够治疗脊髓损伤和其他退行性疾病。Nicola等[12]体内实验发现，DPSC可降低脊髓损伤中早期神经元细胞凋亡，有助于组织和运动神经元的保存。Apel等[13]研究表明，DPSC在阿尔茨海默氏病和帕金森病体外模型中能够保护主要神经元，起营养神经的作用。有研究证明，DPSC具有更强的神经保护作用和促进视网膜神经节细胞神经突生成作用[14]。

2.7 炎症牙髓组织再生 由于牙髓干细胞来源局限，而成人不可逆性牙髓炎的发生非常普遍，不可逆性牙髓炎中是否存在一类具有干细胞特性的牙髓细胞？是否能应用于组织再生[26]？2010年Alongi等[27]从牙髓炎（inflamed pulps，IPs）中分离出牙髓干细胞（DPSCs-IPs），免疫组织化学分析显示DPSCs-IPs表达 STRO-1、CD90、CD105和 CD146等间充质干细胞标记。将DPSCs-IPs植入免疫缺陷小鼠体内，可形成牙髓牙本质复合体。2012年Pereira等[28]比较从正常牙髓和炎症性牙髓中分离的牙髓干细胞特性，发现两者形态、增殖率和分化潜力相似，表明炎症过程并不影响干细胞特性。2017年Nakashima等[29]对5例不可逆性牙髓炎患者分离、培养牙髓干细胞，再将其植入牙齿中，其中3例形成有功能的牙本质。因此，DPSCs-IPs凭借在体内的组织再生潜能，可作为再生医学的“种子细胞”。

治愈系绘本通常是符合大众审美的绘本，使用一些温暖的色调，可爱的人物形象并且又富于想象的分镜，这样特点都能够是读者感受到来自绘本画师的温暖与宁和。治愈系绘本的还具有趣味性，但是治愈系绘本的趣味性不仅仅是通过可爱的人物形象或者是幽默的故事情节来表现，而是通过感染读者的内心，治愈系绘本就想是桥梁一样沟通读者与绘本画师的内心，来让读者产生共鸣。治愈系绘本通常运用简单的故事来传达一些正能量，每个简单的故事中又蕴含了不同的大大小小生活中的一些道理。它可以是读者能够有所触动，也能够体现一些我国我弘扬的社会主义核心价值观，还能够引发读者的深思。这些都能够通过治愈系绘本的方方面面有所体会。

李离愀然不乐：“我父亲说，龙化为鱼，十年为期，意思是长安城不出十年，就会被叛军打破，你说到那个时候，写这首诗的吏部郎中王维大人，会不会降？”

2.5 组织工程牙 Yu等[18]研究显示，在大鼠模型中DPSC与根尖蕾细胞组成的微球形成典型的牙齿样组织，其牙釉质、牙本质构成均衡。Lee等[19]采用3D打印技术形成微支架，利用DPSC产生牙本质、牙骨质、牙周膜和牙槽骨复合物。施松涛教授提出的“再生生物牙根”概念，首次在小型猪颌骨内获得成功[20]。

2.4 修复循环系统 已有许多研究报道，MSC移植可改善心肌梗死。Gandia等[15]将DPSC注入心肌梗死裸大鼠模型内，发现血管生成增加，心肌梗死面积减少，左心室功能改善。Nagpal等[16]临床试验证明，体外扩增后的DPSC颅内注射入脑梗部位，能改善中风后遗症。研究显示，DPSC移植到脑卒中病灶后，2.3%的移植细胞存活，可以分化为星形胶质细胞。在脑缺血动物模型中，回植DPSC4周后，前肢感觉运动功能得到显著改善。DPSC干细胞疗法可改善卒中患者的预后[17]。

2.8 DPSC的免疫调节作用 Pierdomenico等[30]研究表明，在异体骨髓移植中DPSC抑制植物血凝素刺激的T细胞增殖，其抑制效果优于骨髓干细胞与T细胞混合培养。Yamaza等[31]研究发现，DPSC的免疫调节特性可用于治疗SLE，DPSC移植抑制Th17活性，上调并恢复外周血中Tregs/Th17比率，逆转MRL/lpr狼疮鼠的系统性红斑狼疮表型，并可重建SLE患者和狼疮鼠的成骨壁龛。

3 DPSC外泌体

外泌体是细胞分泌的微小囊泡，是各种直径30～100nm的膜性构件的总称[32]，能被大部分细胞释放、摄取，促进细胞间的交流[33]。外泌体包含RNA物质（信使RNA和微RNA）、胞浆蛋白和反膜蛋白[34]。DPSC能迁移至受损的组织区域，分泌多种功能因子并支持受损组织再生，其中DPSC释放的外泌体参与细胞间旁分泌的相互作用，通过诱发内源性修复过程来发挥治疗作用[2]。在前体药物5-FC存在的条件下，经酵母尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因修饰的DPSC释放的外泌体能够入侵并杀死肿瘤细胞[35]。因此，从这些基因重新编码的细胞中分泌的外泌体有可能成为新一代的医学生物产品[2]。Huang等[3]在1 cm×1 cm临床级Ⅰ型胶原膜（Zimmer CollaCote）上添加DPSC来源的外泌体，然后播种DPSC，将膜放入厚度3～4 mm的人牙根切片根管内，植入裸鼠背部皮下2周，免疫荧光和HE染色发现牙根切片的根管空间内有牙髓样组织再生。人骨髓间充质干细胞（HMSC）内吞DPSC来源的外泌体后，牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）基因表达增加，可更有效介导HMSC的牙源性分化。Pivoraite˙等[36]研究首次证明，从人牙髓干细胞中提取的外泌体可抑制卡拉胶诱导的小鼠急性炎症反应。牙髓干细胞外泌体的应用，不需要直接使用细胞，从而避免细胞移植相关的限制和风险。

不少公司在市场经济经营发展过程中，通过兼并或者重组等方式，进一步加快公司的多元化经营战略或者是规模扩张，在公司的经营发展过程中面临的财务风险也越发加剧。根据外部经济发展环境趋势，结合公司内部管理实际需要，创新完善公司的财务风险管控体系，已经成为当前公司经营管理的重要内容，这对于确保公司经营发展正常稳健，提高公司的市场竞争力也具有重要的意义。

4 问题和展望

牙髓干细胞凭借其安全性、易获取、体外培养增殖能力强、免受伦理争议等优势，成为干细胞治疗的明星细胞之一。DPSC主要来源于阻生的智齿和正畸拔出的牙，从脱落的乳牙，甚至炎症牙髓组织也可获取具有一定再生功能的牙髓干细胞。DPSC来源丰富，长期低温保存而不丧失多向分化的能力，为牙髓干细胞储存银行的开建奠定理论基础。然而，在DPSC的临床应用中仍有许多问题。牙髓干细胞在体外培养扩增较难，对于如何选择性能最好的DPSC进行移植，细胞附着的支架以及细胞移植受体区域的微环境等问题不甚明了，需要进一步探索和研究。

[参考文献]

[1]Gronthos S，Mankani M，Brahim J，et al.Postnatal human dental pulp stem cells（DPSCs）in vitro and in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97（25）：13625-13630.

[2]Altanerova U，Benejova K，Altanerova V，et al.Dental pulp mesenchymal stem/stromal cells labeled with Iron sucrose release exosomes and cells applied intra-nasally migrate to intracerebral glioblastoma［J］.Neoplasma，2016，63（6）：925-933.

[3]Huang CC，Narayanan R，Alapati S，et al.Exosomes as biomimetic tools for stem cell differentiation：Applications in dental pulp tissue regeneration［J］.Biomaterials，2016，111（111）：103-115.

[4]Atari M，Barajas M，Hernández-Alfaro F，et al.Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp［J］.Histol Histopathol，2011，26（8）：1057-1070.

[5]Iohara K，Imabayashi K，Ishizaka R，et al.Complete pulp regeneration after pulpectomy by transplantation of CD105+stem cells with stromal cell-derived factor-1［J］.Tissue Eng Part A，2011，17（15/16）：1911-1920.

[6]Nakashima M，Mizunuma K，Murakami T，et al.Induction of dental pulp stem cell differentiation into odontoblasts by electroporation-mediated gene delivery of growth/differentiation factor 11（Gdf11）［J］.Gene Ther，2002，9（12）：814-818.

[7]Fujii Y，Kawase-Koga Y，Hojo H，et al.Bone regeneration by human dental pulp stem cells using a helioxanthin derivative and cell-sheet technology［J］.Stem Cell Res Ther，2018，9（1）：24.

[8]马子洋，郭晓霞.牙髓干细胞在再生医学中的应用研究与进展［J］.中国组织工程研究，2016，20（19）：2872-2878.

[9]Ullah I，Park JM，Kang YH，et al.Transplantation of human dental Pulp-Derived stem cells or differentiated neuronal cells from human dental Pulp-Derived stem cells identically enhances regeneration of the injured peripheral nerve［J］.Stem Cells Dev，2017，26（17）：1247-1257.

[10]Nicola FC，Rodrigues LP，Crestani T，et al.Human dental pulp stem cells transplantation combined with treadmill training in rats after traumatic spinal cord injury［J］.Braz J Med Biol Res，2016，49（9）：e5319.

[11]Zhang J，Lu X，Feng G，et al.Chitosan scaffolds induce human dental pulp stem cells to neural differentiation：potential roles for spinal cord injury therapy［J］.Cell Tissue Res，2016，366（1）：129-142.

[12]Nicola FDC，Marques MR，Odorcyk F，et al.Neuroprotector effect of stem cells from human exfoliated deciduous teeth transplanted after traumatic spinal cord injury involves inhibition of early neuronal apoptosis［J］.Brain Res，2017，1663：95-105.

[13]Apel C，Forlenza OV，De Paula V，et al.The neuroprotective effect of dental pulp cells in models of Alzheimer’s and Parkinson’s disease［J］.J Neural Transm，2008，116（1）：71-78.

[14]孙艳艳，袁梦桐，胡伟平.牙髓干细胞的研究与应用［J］.实用口腔医学杂志，2016，32（3）：426-429.

[15]Gandia C，Arminan A，Garcia-Verdugo JM，et al.Human dental pulp stem cells improve left ventricular function，induce angiogenesis，and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction［J］.Stem Cells，2008，26（3）：638-645.

[16]Nagpal A，Kremer KL，Hamilton-Bruce MA，et al.TOOTH（the open study of dental pulp stem cell therapy in humans）：study protocol for evaluating safety and feasibility of autologous human adult dental pulp stem cell therapy in patients with chronic disability after stroke［J］.Int J Stroke，2016，11（5）：575-585.

[17]Leong WK，Henshall TL，Arthur A，et al.Human adult dental pulp stem cells enhance poststroke functional recovery through non-neural replacement mechanisms［J］.Stem Cells Transl Med，2012，1（3）：177-187.

[18]Yu J，Wang Y，Deng Z，et al.Odontogenic capability：bone marrow stromal stem cells versus dental pulp stem cells［J］.Biol Cell，2007，99（8）：465-474.

[19]Lee CH，Hajibandeh J，Suzuki T，et al.Three-dimensional printed multiphase scaffolds for regeneration of periodontium complex［J］.Tissue Eng Part A，2014，20（7/8）：1342-1351.

[20]唐亮，金岩，王松灵，等.以转化为导向的口腔医学与干细胞研究［J］.北京大学学报:医学版，2011（1）：1-5.

[21]Yang R，Chen M，Lee CH，et al.Clones of ectopic stem cells in the regeneration of muscle defects in vivo［J］.PLoS One，2010，5（10）：e13547.

[22]Martínez-Sarrà E，Montori S，Gil-Recio C，et al.Human dental pulp pluripotent-like stem cells promote wound healing and muscle regeneration［J］.Stem Cell Res Ther，2017，8（1）：175.

[23]Song B，Jiang W，Alraies A，et al.Bladder smooth muscle cells differentiation from dental pulp stem cells：future potential for bladder tissue Engineering［J］.Stem Cells Int，2016，2016：6979368.

[24]Pisciotta A，Riccio M，Carnevale G，et al.Stem cells isolated from human dental pulp and amniotic fluid improve skeletal muscle histopathology in mdx/SCID mice［J］.Stem Cell Res Ther，2015，6：156.

[25]陈玉英.牙髓干细胞应用于肌腱/韧带组织再生的体内外研究［D］.福州：福建医科大学，2015：1-88.

[26]Wang Z，Pan J，Wright JT，et al.Putative stem cells in human dental pulp with irreversible pulpitis：an exploratory study［J］.J Endod，2010，36（5）：820-825.

[27]Alongi DJ，Yamaza T，Song Y，et al.Stem/progenitor cells from inflamed human dental pulp retain tissue regeneration potential［J］.Regen Med，2010，5（4）：617-631.

[28]Pereira LO，Rubini MR，Silva JR，et al.Comparison of stem cell properties of cells isolated from normal and inflameddental pulps［J］.Int Endod J，2012，45（12）：1080-1090.

[29]Nakashima M，Iohara K，Murakami M，et al.Pulp regeneration by transplantation of dental pulp stem cells in pulpitis：a pilot clinical study［J］.Stem Cell Res Ther，2017，8（1）：61.

[30]Pierdomenico L，Bonsi L，Calvitti M，et al.Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp［J］.Transplantation，2005，80（6）：836-842.

[31]Yamaza T，Kentaro A，Chen C，et al.Immunomodulatory properties of stem cells from human exfoliated deciduous teeth［J］.Stem Cell Res Ther，2010，1（1）：5.

[32]Raposo G，Stoorvogel W.Extracellular vesicles：exosomes，microvesicles，and friends［J］.J Cell Biol，2013，200（4）：373-383.

[33]Yu B，Zhang XM，Li XR.Exosomes derived from mesenchymal stem cells［J］.Int J Mol Sci，2014，15（3）：4142-4157.

[34]Théry C，Zitvogel L，Amigorena S.Exosomes：composition，biogenesis and function［J］.Nat Rev Immunol，2002，2（8）：569-579.

[35]Altaner C，Altanerova V，Cihova M，et al.Complete regression of glioblastoma by mesenchymal stem cells mediated prodrug gene therapy simulating clinical therapeutic scenario［J］.Int J Cancer，2014，134（6）：1458-1465.

[36]Pivoraite˙U，Jarmalavicˇiūte˙A，Tunaitis V，et al.Exosomes from Human DentalPulp Stem CellsSuppressCarrageenan-Induced Acute Inflammation in Mice［J］.Inflammation，2015，38（5）：1933-1941.