Triad1调节K562细胞增殖、凋亡和耐药研究*

慢性髓细胞白血病（CML）是克隆性骨髓增生性疾病，其特征在于第9号和第22号染色体长臂断裂、平行交叉易位，产生Ph染色体，导致具有酪氨酸激酶活性、促进髓系细胞增殖失控的BCR-ABL融合蛋白形成[1]。酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）被认为是CML治疗的金标准，其中甲磺酸伊马替尼（IM）可使80%初发CML患者获得完全细胞遗传学和血液学反应。然而，随着TKIs的广泛应用，耐药问题越来越严重，阻碍了疗效，使得加速期或急变期患者增加，20%～25%IM治疗患者中可观察到IM耐药和疾病进行性进展的分子学证据[2-3]。

蛋白质泛素化在各种细胞进程中起重要作用。蛋白质被E2-E3泛素连接酶复合物泛素化，并被靶蛋白酶体降解，或其活性被特异性地改变。泛素化还影响调节许多控制造血功能的重要蛋白质的活性。Triad1，也称为ARIH2，是一种泛素连接酶，在粒细胞和单核细胞分化过程中高度表达[4-5]。Triad1及其结合蛋白参与骨髓集落形成和细胞周期调节。K48或K63连接的泛素链与Triad1以及Ubc7或Ubc13（E2连接酶）的相互作用有关[6-7]。EGF-R和GHR在上皮细胞中的溶酶体降解也涉及Triad1[8]。此外，Triad1促进MDM2在各种细胞类型中蛋白酶体降解，可以抑制MDM2降解p53[9]。Triad1位于染色体3p21上，曾有AML和CML中该区域缺失的报道[10-11]。还有研究表明，Triad1在p53-MDM2轴上起作用，并且可作为一种新的调节因子[12]。

研究表明，Triad1功能与许多癌症如AML和APL相关，但在CML以及CML耐药中的作用尚未阐明。本研究以慢性髓细胞白血病细胞株K562为研究对象，发现Triad1可以抑制K562细胞增殖，在耐药K562细胞中Triad1表达减少，并探讨了相关机制，报告如下。

3.6 专间。处理或短时间存放直接入口食品的专用加工制作间，包括冷食间、生食间、裱花间、中央厨房和集体用餐配送单位的分装或包装间等。

1 材料与方法

1.1 伊马替尼耐药细胞K562R的建立 将K562细胞从0.05 μmol/L IM初始浓度开始培养，然后每周以2倍增加药物浓度，使终浓度达到3.2 μmol/L。为保持选择压力，维持抗性细胞在1 μmol/L IM下培养，全程约需6个月。以不同浓度IM分别处理K562细胞和K562细胞24h，CCK8检测IC50值，评估对细胞的毒性作用，显示K562与K562R细胞IC50比为85∶1，证实K562R耐药模型构建成功，其对IM维持较高水平耐药性。

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2.2 敲除Triad1对K562细胞增殖、凋亡的影响K562细胞用Triad1 shRNA及其各自对照转染，并用嘌呤霉素筛选稳定克隆。Western blot检测显示，与对照以及其他2种Triad1 shRNA比较，shTriad1-1对Triad1表达的干扰效果最好，差异有统计学意义（P＜0.05）（图 2B，见封二），因此选择 shTriad1-1进行以下实验。流式细胞仪检测显示，与对照组相比，干扰Triad1的K562细胞G1期明显降低，S期细胞增多（图2C，见封二），凋亡细胞减少（图2D，见封二）。

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1.4 细胞周期检测 收集对数生长期K562细胞，预冷PBS洗涤2次，70%乙醇固定超过24h。离心后，加入 500 μL细胞周期试剂（Beyotime）充分混合，37℃避光温育20 min，收集约10 000个细胞上流式细胞仪。

1.5 细胞凋亡检测 K562细胞用冷PBS洗涤3次，重悬于缓冲液（BioLegend，San Diego，CA，USA）中，取 100 μL 细胞悬液加入 5 μL AnnexinV-FITC混匀，再加 5 μL 碘化丙锭（PI）混匀，室温避光 15min，再加入400 μL缓冲液后上流式细胞仪。

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TKIs的应用极大改变了CML患者的预后，IM治疗患者的10年总生存率（OS）为82%，接近正常人群。在新发CML慢性期患者中，IM治疗12个月后完全血液学缓解率97%，完全细胞遗传学缓解率63%，仅7%患者进入加速期或者急变期。克服IM耐药已成为目前主要的挑战，为此必须进一步了解IM耐药的相关分子机制。

2 结 果

2.3 Triad1表达与K562细胞耐药相关 Westernblot分析显示，K562R耐药细胞Triad1蛋白表达水平明显减少，同时活化caspase-3和活化PARP凋亡标志蛋白明显减少，而MDM2蛋白表达增加。见图3。推测Triad1可能通过调节p53和MDM2表达，与K562细胞的耐药相关。

1.3 Western Blot检测 收集细胞，冰上裂解20～30 min，置 4℃离心机，12 000 r/min，20 min，取上清液，以 4∶1体积与 SDS-PAGE 蛋白上样（5×）缓冲液混合。取适量上样，电泳、转膜、封闭后，cyclinE、CDK2、PCNA、caspase-3、p53、MDM2 一抗孵育，4℃过夜，摇床洗涤。室温二抗孵育2h，洗涤后显影液A液、B 液（1∶1）混匀，避光滴入显影剂，孵育 1～2 min，多次曝光拍照。

2.1 Triad1通过调节细胞周期抑制K562细胞增殖为了探讨Triad1和K562细胞生长的关系，先将K562细胞置于无血清培养基进行饥饿培养（S）72 h，再加入10%FBS（R），收集不同时间点（6 h、12 h、24 h、48 h）细胞。流式细胞仪测定显示，与S 72 h相比，加入血清后G1期细胞比例逐渐减少，S期细胞逐渐增多，差异有统计学意义（P＜0.05），提示血清喂养使阻滞在G1期的细胞进入S期，促进了G1/S期的转化。见图1（见封二）。Westernblot分析显示，血清再喂养后Triad1表达逐渐下降，同时伴随cyclinE、CDK2、PCNA的上调，提示Triad1可能在抑制K562细胞增殖中发挥作用。见图2A（见封二）。

  

图1 K562细胞饥饿培养72小时以及血清喂养后不同时间点细胞周期

  

图2 敲除Triad1对K562细胞增殖、凋亡的影响

  

图3 K562和K562R细胞Triad1及相关蛋白检测

3 讨 论

1.6 统计学处理 应用SPSS20.0进行数据处理分析，计量资料两组间差异性比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

1.2 shRNA的制备和转染 取对数生长期细胞，平铺至6孔板，37℃培养，至细胞密度60%～80%时，取5 μL Lipo 2000与0.5 mL Opti-MEM培养基反应，混匀静置 5 min。取 8～10 μL shRNA 与 0.5 mL Opti-MEM培养基反应，混匀静置5 min。混合shRNA和Lipo 2000，轻轻摇匀，静置20 min。将混合物加入孔板中，轻混匀，加基培至2 mL，孵育6h后更换成完培。培养48～72 h后，在2 μg/mL嘌呤霉素存在下选择表达shRNA的稳定克隆。每3～5天用新鲜的含有嘌呤霉素培养基代替培养物，然后挑取并继续传代抗性细胞。收获细胞用于进一步分析。

有报道发现Triad1与急性白血病密切相关，但是Triad1在CML中究竟发挥什么样作用仍然未知。本研究首先探讨了Triad1在K562细胞中的生物学功能及可能机制，饥饿释放实验结果显示，Triad1在抑制K562细胞增殖中发挥作用。细胞增殖通常与细胞周期密不可分，因此进一步探讨Triad1是否是通过影响细胞周期来抑制K562细胞的增殖。流式细胞分析发现，Triad1干扰后，K562处于G1期的细胞明显减少，同时PCNA等蛋白表达上调。同时，我们还检测了P53以及MDM2的表达，发现Triad1参与P53-MDM2轴。综上所述，我们的研究提示，Triad1主要通过调节细胞周期、细胞凋亡及IM介导的耐药中发挥作用。

Triad1通过调节细胞周期抑制K562增殖的具体机制及信号通路目前尚不清楚，在增殖的K562细胞中，Triad1低表达导致G1期细胞停滞减少。Triad1是一种E3泛素连接酶，泛素蛋白酶体系统与正常和恶性血细胞生成密不可分，三个酶家族发挥协同作用[13]。TRIAD1在调节骨髓祖细胞增殖、NF-κB信号传导和膜运输中发挥重要作用[8，13-14]。p53蛋白是调节细胞生长、衰老、DNA修复和存活的转录因子，在造血系统中调节正常造血干细胞的自我更新[15]。在IM耐药细胞K562R中，在Triad1低表达的同时，P53表达减少，猜测Triad1以p53依赖方式促进细胞凋亡。

总之，Triad1可作为一种重要的白血病调控因子，在CML细胞株的增殖和IM耐药中发挥作用，敲减Triad1可促进细胞增殖，减少凋亡。本研究结果有助于理解Triad1在CML中的作用，并为改善CML的治疗提供理论依据。

第一，把好选苗关。种龟试蛋产出的苗和病龟产蛋孵化出的龟苗都会出现体质较弱的特点，在饲养过程中容易出现问题；年轻种龟苗抗病能力低，老种龟苗为上选；最傻瓜的方法：买大不买小，还要搞清楚是自然孵化出的还是加温孵化出的，前者抗病能力强。

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