漆酶对纤维素酶催化作用的影响

植物木质纤维素作为地球上最丰富的可再生资源，它的转化利用正受到越来越多的重视。木质纤维素除被用于生产纤维乙醇[1]、纤维丁醇[2]等生物质能源外，还被用于生产琥珀酸[3]、葡萄糖酸[4]等多种生物基产品。事实上，木质纤维素转化利用的关键环节在于如何高效地将木质纤维素水解为可发酵性糖。目前，木质纤维素原料的水解普遍采用“预处理(酸、碱、蒸汽爆破、湿氧化法等)+酶解”的工艺[5]。其中，酶解主要指包括内切β-1,4-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶在内的纤维素酶系的协同作用[6]。

漆酶(EC 1.10.3.2)是一种含铜的氧化还原酶，能够催化氧化大多数带有自由酚基的木质素模型化合物。漆酶通过连续的单电子氧化作用，使底物形成中间产物苯氧基团，苯氧基团进一步发生非酶催化的裂解反应，使芳基与α碳原子之间的化学键断裂[7-8]。由于漆酶可以降解木质纤维素中的木质素结构，因而作为一种木质素降解酶被用于木质纤维素原料的预处理过程中[9]。邱伟华等[10]证实经蒸汽爆破和漆酶作用后的小麦秸秆，再用纤维素酶处理时糖化能力增强，这是因为漆酶能氧化木质素中的芳香环，从而暴露了纤维素酶的作用位点；ANTONIO等[11]认为经漆酶处理后的玉米秸秆，再用维酵母(K.marxianus)进行发酵，不仅能缩短该菌株的停滞期，还可以提高乙醇的产量。然而，有关漆酶作用于木质纤维素的效果也有报道得出了相反的结论。WANG等[12]提出，漆酶作用于玉米秸秆底物后产生的木质素降解物抑制了纤维素酶的活性，致使纤维素酶水解糖化玉米秸秆的能力下降。冯冲等[13]研究结果显示，漆酶等木质素降解酶类对于纤维素酶存在抑制作用。为阐明漆酶对后续水解体系中纤维素酶作用的影响，本研究采用纯化的漆酶，探究了在有无漆酶存在的情况下，纤维素酶作用于滤纸和纤维素工业生产中玉米秸秆汽爆物料时的糖得率变化，为工业生产中玉米秸秆糖化条件的优化提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米秸秆取自河南农业大学毛庄农场；新华1号滤纸购于广州竞力化玻仪器有限公司；漆酶购于Sigma(中国)公司；酸性纤维素酶购自于苏柯汉公司；其他试剂均为分析纯，购于北京康为试剂公司。

（1）结构形式对造价成本的影响。结构形式的选择是建筑结构设计的重要内容，结构形式的选择需要符合建筑物主体的使用标准，只有这样，结构形式才能够促进建筑结构安全可靠建设，同时，还能够保证造价成本的经济可控以及建筑物的美观舒适。因此，只有设计人员对所有结构形式充分了解，充分把握每种结构形式的优缺点，才能选择科学合理的结构形式，从而达到减少投资成本的目的。

1.2 玉米秸秆汽爆物料的制备

将玉米秸秆置于75 ℃烘箱烘干，粉碎至10目后灭菌。采用鹤壁正道生物能源有限公司生产的QB-20B 型号的蒸汽爆破设备，在2.0 MPa、150 s的条件下进行高压蒸汽爆破。并利用上海雷韵公司生产的HH-12型号恒温培养箱75 ℃烘干备用。

1.3 供试酶酶活性的标定

1.3.1 纤维素酶活性的标定 酶活性单位定义：以滤纸为底物，在一定条件(pH 4.8，50 ℃,恒温1 h)下，每min水解滤纸产生1 μmol葡萄糖为1个酶活性单位，以FPU表示。酶活性测定：向每个反应管中加入pH值为4.8浓度为0.1 mol·L-1醋酸缓冲液1.5 mL，再向反应管中加入50 mg的新华滤纸，分别取103、104、105倍稀释的纤维素酶液0.5 mL加入到相应的试管内，于50 ℃水浴保温60 min，加入2 mL DNS显色液终止反应，沸水浴煮沸10 min，冷却后采用UNICO(上海)公司生产的UV-2802型号紫外分光光度计在550 nm处测定吸光值。

马约翰先生在1948年接待校刊记者时说：“我觉得体育的功效，最重要是培养人格，补充教育的不足，培养一种‘干、干、干！’的精神”他认为体育是教育的重要组成部分，培养全面发展人才的手段，运动场是培养学生品格极好的场所，培养青年们勇敢的精神，坚强的意志，自信心，进取心和争取胜利的决心。

1.4 漆酶对纤维素酶酶解滤纸影响试验

反应体系中加入50 mg滤纸作为纤维素酶底物，根据标定的漆酶酶活性和相关研究方法[12]，分别加入漆酶1(5 IU·mL-1)和漆酶2(0.5 IU·mL-1)，然后均加入5 FPU·mL-1的纤维素酶液，以加入煮沸灭活的纤维素酶液为对照，由pH值为4.8，浓度为0.1 mol·L-1的醋酸缓冲液补齐体积至2.0 mL。置于50 ℃水浴锅内反应60 min，取出后放入冰浴终止酶解反应。各取出0.1 mL反应液于相应的试管内，分别加2 mL DNS显色液，沸水浴煮沸10 min后，向各个试管内加入2.9 mL蒸馏水补足5 mL体系，测定体系在波长550 nm处OD值，根据葡萄糖标准曲线查出葡萄糖质量，计算质量浓度和糖得率，计算公式如下：

2)该类型的非常规细长拉杆，应变电桥改装位置的选择非常重要，如果选择合适的应变电桥改装位置，能保障拉向和压向受载规律一致，在条件限制时可只进行单向的载荷校准试验。

酶解滤纸糖得率

(1)

式中：0.9为单糖到聚糖的转换系数。

1.5 漆酶对纤维素酶酶解玉米秸秆影响试验

1.5.1 漆酶未与秸秆底物先行保温处理 在反应体系中加入玉米秸秆汽爆物料0.5 g，分别加入漆酶1(5 IU·mL-1)和漆酶2(0.5 IU·mL-1)，然后均加入5 FPU·mL-1的纤维素酶液，以加入煮沸灭活的纤维素酶液为对照，由pH值为4.8浓度为0.1 mol·L-1醋酸缓冲液补齐体积至10 mL。置于45 ℃、135 r·min-1的摇床内反应48 h，之后12 000 r·min-1离心10 min，取上清液采用方法1.4中描述的DNS法测定葡萄糖质量，计算质量浓度和糖得率。

1.5.2 漆酶与秸秆底物先行保温处理 在方法1.5.1反应体系中加入玉米秸秆和漆酶后，使漆酶先行与玉米秸秆于45 ℃、135 r·min-1的摇床内温育24 h，再加入5 FPU·mL-1的纤维素酶液继续反应48 h。采用方法1.4中的DNS法测定葡萄糖质量，并计算玉米秸秆水解后的葡萄糖质量浓度和糖得率，计算公式如下：

酶解玉米秸杆糖得率

(2)

式中：0.9为单糖到聚糖的转换系数。

(1)生产组织模式的转变。为促进融合生产，需要打破常规生产的组织模式，进行必要的转变。首先是转变基础地理信息数据生产与地理国情监测各自为战的现状，尽量做到同部署、同区域、同进度，分工序作业转变为分区域并行作业，不同队伍分别完成转变为一支队伍完成整个流程；其次是要打破按图幅、按比例尺局限，转变为按需求、按地理单元或者要素灵活组织生产。

1.6 数据分析

2.3.1 漆酶未与秸秆底物先行保温 根据方法1.5.1，在漆酶未与秸秆底物先行保温条件下，测定漆酶存在下纤维素酶酶解玉米秸秆产生的葡萄糖质量浓度，计算糖得率，结果见表2。玉米秸秆在5 IU·mL-1的漆酶作用下，糖得率降低6.29%，而加灭活漆酶糖得率只降低0.26%，将漆酶与纤维素酶在37 ℃下保温处理30 min后，糖得率降低5.68%；玉米秸秆在0.5 IU·mL-1的漆酶作用下，糖得率降低1.73%，加灭活漆酶糖得率降低0.07%，将漆酶与纤维素酶在37 ℃下保温处理30 min后，糖得率降低3.13%。试验结果表明，漆酶无论是与纤维素酶一同作用于玉米秸秆，还是先与纤维素酶保温30 min再作用于玉米秸秆，都使玉米秸秆降解的糖得率降低，而且玉米秸秆糖得率的降低与漆酶添加量显示出相关关系。

2 结果与分析

2.1 供试纤维素酶和漆酶活性的标定

根据方法1.3，以新华滤纸为底物，测定供试纤维素酶活性，可知纤维素酶活性为601 FPU·g-1；

以愈创木酚为底物，测定供试漆酶酶活性，可知漆酶活性为3.21 IU·mg-1。以标定的酶活性进行以下加酶催化试验。

2.2 漆酶对纤维素酶酶解滤纸的影响

测定不同漆酶处理下纤维素酶酶解滤纸产生的葡萄糖质量浓度，计算糖得率，结果见表1。加漆酶和加灭活漆酶试验组中测得的滤纸水解糖得率变化为试验正常误差范围，没有统计学差异；试验中设置了漆酶与纤维素酶先行37 ℃保温30 min后再加底物滤纸的试验组，其目的是观察漆酶是否对纤维素酶产生直接的作用，各处理组间最终测得的还原糖量差异不显著。由此可见，漆酶的添加量大小及漆酶是否灭活对纤维素酶酶解滤纸的影响不显著。

 

表1 不同量的漆酶对纤维素酶酶解滤纸的影响Table 1 The effects of different addition of lactase on catalytic efficiency of cellulase in the filter paper hydrolysis system

  

处理Treatments漆酶1Laccase1葡萄糖质量浓度/(g·L-1)Glucoseconcentration糖得率/%Sugaryield变化率/%Rateofchange漆酶2Laccase2葡萄糖质量浓度/(g·L-1)Glucoseconcentration糖得率/%Sugaryield变化率/%Rateofchange不加漆酶Untreated4．76±0．11a17．13±0．26—4．76±0．11a17．13±0．26—加漆酶Laccase4．81±0．40a17．34±1．45+0．214．66±0．27a16．78±0．96-0．35加灭活的漆酶Inactivatedlaccase4．86±0．24a17．49±0．87+0．364．67±0．11a16．80±0．40-0．33漆酶与纤维素酶37℃保温30min后加滤纸Preincubatinglaccaseandcellulaseat37℃for30min4．81±0．24a17．30±0．88+0．174．72±0．10a17．01±0．36-0．12

注：同列数据字母不同表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note: In the same column, values with different letters represents significance at level of P<0.05. The same as below.

2.3 漆酶对纤维素酶酶解玉米秸秆的影响

各处理均设3次生物学重复，以SPSS16.0统计软件对不同处理组测得的葡萄糖质量浓度进行差异显著性分析，P值设定在5%水平，分析漆酶对纤维素酶酶解滤纸及玉米秸秆的影响。

2.3.2 漆酶与秸秆底物先行保温处理 根据方法1.5.2，在漆酶与秸秆底物先行保温条件下，测定漆酶存在下纤维素酶酶解玉米秸秆产生的葡萄糖质量浓度，计算糖得率，结果见表3。玉米秸秆先行与漆酶保温24 h再加纤维素酶作用时，在5 IU·mL-1的漆酶作用下，糖得率降低6.53%，与不加漆酶相比差异显著；预先将漆酶灭活后，糖得率提高0.54%，与不加漆酶相比差异不显著。在0.5 IU·mL-1的漆酶作用下，糖得率降低4.12%，与不加漆酶相比差异显著；预先将漆酶灭活后，糖得率提高0.09%，与不加漆酶相比差异不显著。上述结果表明添加漆酶时，玉米秸秆糖得率的降低与漆酶加量显示出了相关关系。

 

表2 不同添加量漆酶对纤维素酶降解玉米秸秆的影响(漆酶未与秸秆底物先行保温) Table 2 The effects of different addition of lactase on catalytic efficiency of cellulase in the corn stover hydrolysis system (no prewarming laccase and corn stover substrate together)

  

处理Treatments漆酶1Laccase1葡萄糖质量浓度/(g·L-1)Glucoseconcentration糖得率/%Sugaryield变化率/%Rateofchange漆酶2Laccase2葡萄糖质量浓度/(g·L-1)Glucoseconcentration糖得率/%Sugaryield变化率/%Rateofchange不加漆酶Untreated16．18±0．21a29．12±0．38—16．18±0．21a29．12±0．38—加漆酶Laccase12．68±0．32b22．83±0．58-6．2915．22±0．09b27．39±0．17-1．73加灭活的漆酶Inactivatedlaccase16．03±0．31a28．86±0．55-0．2616．14±0．13a29．05±0．24-0．07漆酶与纤维素酶37℃保温30min后加玉米秸秆Preincubatinglaccaseandcellulaseat37℃for30min13．02±0．07b23．44±0．12-5．6814．44±0．39b25．99±0．71-3．13

本研究显示，各处理组间测得的葡萄糖质量浓度存在显著的差异性。漆酶的添加量及漆酶是否灭活对纤维素酶催化降解玉米秸秆的活性的影响极显著。加入具有活性的漆酶后，玉米秸秆的糖得率降低，当漆酶被灭活后，其糖得率与对照相比并无显著变化，可见漆酶在纤维素酶水解糖化玉米秸秆时起到了抑制作用，且漆酶的添加量越高，抑制效果越明显，灭活的漆酶其抑制作用基本被解除。

在时间序列一阶单整的前提下，紧接着进行协整检验，判断本文所构建模型中的被解释变量与各解释变量是否存在长期均衡关系，避免出现伪回归。

试验结果证实，在漆酶与秸秆底物先行保温再加入纤维素酶的催化体系中，加入的漆酶同样对纤维素酶糖化秸秆起了抑制作用，测得还原糖量与不加漆酶对照组相比差异极显著。当漆酶被灭活后，这种显著性差异消失，抑制作用解除。与漆酶未与秸秆底物先行保温试验相比，漆酶对糖化的抑制作用稍显增强。

 

表3 不同添加量漆酶对纤维素酶降解玉米秸秆的影响(漆酶与秸秆底物先行保温) Table 3 The effect of different addition of lactase on catalytic efficiency of cellulase in the corn stover hydrolysis system (prewarming laccase and corn stover substrate together)

  

处理Treatments漆酶1Laccase1葡萄糖质量浓度/(g·L-1)Glucoseconcentration糖得率/%Sugaryield变化率/%Rateofchange漆酶2Laccase2葡萄糖质量浓度/(g·L-1)Glucoseconcentration糖得率/%Sugaryield变化率/%Rateofchange不加漆酶Untreated16．89±0．34a30．40±0．62—16．89±0．34a30．40±0．62—加漆酶Laccase13．26±0．74b23．87±1．33-6．5314．60±0．68b26．28±1．22-4．12加灭活的漆酶Inactivatedlaccase17．19±0．15a30．94±0．27+0．5416．94±0．66a30．49±1．19+0．09

3 结论与讨论

本研究证实，在纤维素酶降解滤纸的体系中，漆酶是否灭活对纤维素酶的影响不显著，漆酶的添加量均对纤维素酶的糖化作用无显著影响。而在纤维素酶降解玉米秸秆的体系中，加入具有活性的漆酶时，玉米秸秆的糖得率降低；而且漆酶的添加量越高，葡萄糖质量浓度降低幅度越显著。漆酶对纤维素酶酶解滤纸无显著影响，对纤维素酶酶解玉米秸秆有显著抑制，推测其可能的原因是，与底物滤纸相比，玉米秸秆爆破物中存在大量的木质素。虽然漆酶被频繁报道可以脱除木质素成分，且木质纤维素中木质素的去除有利于纤维素成分的暴露，从而利于后续纤维素酶的水解[14-15]，但是漆酶在作用于木质素成分时，不能排除新的酚羟自由基形成、进而酚羟自由基抑制后续纤维素酶作用的可能性，最终造成糖得率的下降。而在滤纸降解体系中，由于不存在或极少存在木质素成分，添加的漆酶不会产生相应的降解物，因而漆酶不会影响纤维素酶对滤纸的降解作用，这与本试验结果一致。本研究设置的漆酶与秸秆底物先行保温再加入纤维素酶的催化体系中，漆酶对纤维素酶的抑制作用稍强于未先行保温的体系，该结果与上述推测原因相符，即在先行保温的过程中，漆酶对玉米秸秆中木质素的充分作用使木质素的降解物得到充分释放，从而更大程度地抑制了后续纤维素酶的水解糖化作用。

其中，α为常数项，β为待估系数，y为被解释变量，χ解释变量，ε为随机扰动项；i为省区标志，t为时期标志。根据面板数据模型的一般形式，本文建立如下分析劳动力成本对制造业结构影响的面板数据模型：

本研究以漆酶纯酶(Sigma)为供试酶，探究了漆酶对纤维素酶作用的影响，发现在纤维素酶降解滤纸和降解玉米秸秆的不同体系中，漆酶表现出了不同的效应。其对作用于玉米秸秆时表现出的抑制作用与TABKA等[14]和WANG等[12]报道的添加漆酶抑制纤维素酶活性，致使纤维素酶糖化小麦秸秆或玉米秸秆的糖得率降低的结论相吻合。但是，QIU等[10]研究表明，添加漆酶可以显著提高纤维素酶对汽爆小麦秸秆的水解效率。DAVIDI等[15]研究也表明，在小麦秸秆水解过程中加入整合有漆酶的纤维小体可以使水解液中的葡萄糖糖得率提高2倍。这与本研究结果相悖，其原因可能是由于不同研究者试验所用木质纤维素类型、预处理方法、酶解体系和测量的条件方法均有所差异，最关键的是所加漆酶的来源和纯度也不相同。AVANTHI等[16]、ELEGIR等[17]和WONG等[18]研究所用漆酶均来自不同菌株发酵的粗酶液，而漆酶粗酶液并不能排除其中含有纤维素酶和半纤维素酶成分，因此可能使漆酶针对纤维素酶显示出的抑制作用在某些试验体系中被掩盖了。而本研究采用纯化漆酶进行了糖化试验，则清晰直观地证实了漆酶的存在确实对纤维素酶后续的糖化作用起到抑制作用，且抑制作用随漆酶添加量的增加而愈加显著。

参考文献：

[1] ZHAO X Q, ZI L H, BAI F W, et al. Bioethanol from lignocellulosic biomass[J]. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, 2012, 128(1):25-52.

案例企业社会责任行为说明：2018年1月19日，在《证券日报》主办的第一届新时代资本论坛上，首届“金骏马奖”评选结果出炉。中化国际荣获金骏马“最具社会责任上市公司”奖。“最具社会责任上市公司奖”主要表彰新时代资本市场上持续履行社会责任的杰出企业。中化国际作为国家“一带一路”国际合作倡议的先行者，沿“一带一路”国家和地区深入践行了大量社会责任，是中国国家化企业履行社会责任的典型代表。

[2] 王风芹, 谢媱嬛, 苏增平,等. 酶法复合脱毒提高玉米秸秆水解液丁醇发酵效率[J]. 农业工程学报, 2017, 33(8):204-210.

[3] AKHTAR J, IDRIS A, AZIZ R A. Recent advances in production of succinic acid from lignocellulosic biomass[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2014, 98(3):987-1000.

[4] ZHANG H S, ZHANG J, BAO J. High titer gluconic acid fermentation by Aspergillus niger from dry dilute acid pretreated corn stover without detoxification[J]. Bioresource Technology, 2016, 203:211-219.

创新的首要要素是创造力 ，创造力是创新的前端，是创新的“种子”，是创新实现的第一步[1]。特殊创造力为创造力罩上了一层“神秘的面纱”，使创造力久居“神坛”之上。以往创造力的研究并没有对创造力加以区分，而是统一使用一个包含的概念，这种包含性使得创造力的研究对象和内容始终处于模糊之中。提出“一般创造力”这一概念，阐述其内涵实质、存在机制及其影响因素，对于加深对创造力的理解和深入研究创造力有着重要意义。

县人大常委会在“双联”工作中，坚持把“双联”工作与县委中心工作相结合，找准切入点，助力全县重点工作扎实开展。

[5] ALVIRA P, TOMSPEJ E, BALLESTEROS M, et al. Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(13):4851-4861.

戴菲儿起身，离开餐桌。她看看艾莉，说，现在你可以安心住在这里了。这里所有的一切，包括我，全都属于你和秦川。

1.3.2 漆酶活性的标定 酶活性单位定义：每min催化氧化1 μmol愈创木酚所需的酶量为1个酶活性单位，以IU表示。酶活性测定：向每个反应管中加入pH值为4.5浓度为50 mmol·L-1的琥珀酸钠缓冲液4.5 mL，再加入浓度为10 mmol·L-1的愈创木酚溶液0.2 mL，混匀后，分别取103、104、105倍稀释的漆酶酶液0.3 mL加入到相应的试管中，同时以煮沸灭活的漆酶酶液作为对照。将上述反应体系置于30 ℃温育30 min后，冰水冷却终止反应，于465 nm波长处测定吸光值。

[7] 卢蓉, 夏黎明. 漆酶氧化还原介质系统的作用机理及其应用[J]. 纤维素科学与技术, 2004, 12(1):37-44.

[8] 池玉杰, 伊洪伟. 木材白腐菌分解木质素的酶系统-锰过氧化物酶、漆酶和木质素过氧化物酶催化分解木质素的机制[J]. 菌物学报, 2007, 26(1):153-160.

[6] 徐桂转, 范帅尧, 杨君芳,等. 纤维素酶液体混菌发酵培养基的优化研究[J]. 河南农业大学学报, 2011, 45(6):688-691.

[9] HEAP L, GREEN A, BROWN D, et al. Role of laccase as an enzymatic pretreatment method to improve lignocellulosic saccharification[J]. Catalysis Science & Technology, 2014, 4(8):2251-2259.

[10] QIU W, CHEN H. Enhanced the enzymatic hydrolysis efficiency of wheat straw after combined steam explosion and laccase pretreatment[J]. Bioresource Technology, 2012, 118(4):8-12.

[11] MORENO A D, IBARRA D, FERNáNDEZ J L, et al. Different laccase detoxification strategies for ethanol production from lignocellulosic biomass by the thermotolerant yeast Kluyveromyces marxianus CECT 10875.[J]. Bioresource Technology, 2012, 106(2):101-109.

[12] WANG F Q, XIE H, CHEN W, et al. Biological pretreatment of corn stover with ligninolytic enzyme for high efficient enzymatic hydrolysis[J]. Bioresource Technology, 2013, 144(3):572-578.

[13] 冯冲, 陈伟, 杜风光,等. 木质素降解酶对纤维素酶水解糖化的抑制作用[J]. 河南农业大学学报, 2011, 45(5):577-580.

[14] TABKA M G, HERPO⊇L-GIMBERT I, MONOD F, et al. Enzymatic saccharification of wheat straw for bioethanol production by a combined cellulase xylanase and feruloyl esterase treatment[J]. Enzyme & Microbial Technology, 2006, 39(4):897-902.

[15] DAVIDI L, MORAÏS S, ARTZI L, et al. Toward combined delignification and saccharification of wheat straw by a laccase-containing designer cellulosome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113(39):10854.

[16] AVANTHI A, BANERJEE R. A strategic laccase mediated lignin degradation of lignocellulosic feedstocks for ethanol production[J]. Industrial Crops & Products, 2016, 92:174-185.

湿法氧化分解钼精矿方法制备的氧化钼的氨不溶钼低，提高了从氧化钼到钼酸铵过程的金属转化率，具体工艺技术参数：反应温度200～220 ℃，氧气分压0.80～1.20 MPa，固液比1∶6～1∶15，搅拌转速500～650 r/min，保温保压时间为300～360 min，在上述工艺技术参数下制备的氧化钼氨不溶钼低于0.50%。

[17] ELEGIR G, BUSSNIN D, ANTONSSON S, et al. Laccase-initiated cross-linking of lignocellulose fibres using a ultra-filtered lignin isolated from kraft black liquor[J]. Applied Microbiology Biotechnology, 2007, 77(4):809-817.

[18] WONG K K, RICHARDSONI J D, MANSFIELD S D. Enzymatic treatment of mechanical pulp fibers for improving papermaking properties.[J]. Biotechnology Progress, 2000, 16(6):1025-1029.