鸽副黏病毒经鸡胚传代引起毒力和F基因序列变化的研究

新城疫(Newcastle disease，ND)是世界公认的2种最重要的禽类传染病之一，被世界动物卫生组织列为法定报告的传染病，其致病原为新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)，又称禽副黏病毒-1型(Avain paramyxovirus，APMV-1)[1]。易感禽类中介于家养和野生中间状态的鸽群在ND传播中起到重要的桥梁作用。鸽新城疫是由鸽I型副黏病毒(Pigeon paramyxo virus type 1,PPMV-1)引起的一种高度接触性传染病，是目前严重危害养鸽业(肉鸽、信鸽和观赏鸽)的主要疫病之一[2]，PPMV首次于1981年在中东地区的鸽体内分离到，它是引起世界范围内第三次NDV大流行的主要毒株[3]。多数学者认为PPMV是经典NDV的变异株[4]，其临床症状和鸡新城疫相似，但在致病性上存在着明显差异。虽然，PPMV对鸡多表现为中等毒力，但是经过鸡胚或鸡传代后毒力会显著增强[5]。研究表明，基因Ⅵb亚型PPMV主要在鸽群中分离到，与当前世界上NDV流行的优势基因Ⅶd亚型并不一致，在20世纪90 年代中后期国内PPMV以基因Ⅵb亚型为主，在2000年后成为绝对优势基因型，且不存在地区差异导致遗传距离差异[6-8]。因此，PPMV具有鲜明的宿主特嗜性。NDV的基因组为不分节段单股负链RNA，基因组结构为 3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，F基因编码的F蛋白位于病毒囊膜表面，是毒力的主要决定因素[9-10]。F蛋白裂解位点的多碱性氨基酸基序是NDV毒力的首要决定因素[11]。PPMV的毒力与F蛋白裂解位点序列特征判定的毒力结果有一定偏差[12]，这在一定程度上表明了PPMV毒力的特殊性[13-14]。本研究先将鸽副黏病毒ND167在SPF鸡胚连续传代，然后测定第1、5和10代次病毒的F基因序列、MDT和ICPI数值，进而研究推导的F蛋白裂解位点氨基酸序列与毒力之间的关系，旨为养鸽业的健康发展提供一些临床建议。

王树林踏上了去省城的动车。四个小时后，他走出车站，一眼就看见不远处一辆别克商务车前伍亦苒笑盈盈的微笑。职业套装。短裙。亭亭玉立。丰采照人。

1 材料与方法

1.1 生物材料

SPF种蛋购自浙江立华农业科技有限公司，由本室自行孵化至10日龄以及出雏；1%鸡红细胞悬液按照OIE标准制备；PPMV ND167(分离自上海某养鸽场发病乳鸽)由中国农业科学院上海兽医研究所丁铲研究员惠赠；新城疫阳性血清购自上海素尔生物科技有限公司。

1.2 主要试剂

GoScriptTM Reverse Transcription System 购自 Promega 公司；TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、E.coli DH5αCompetent Cells、PrimeSTAR? HS DNA Polymerase、Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR® 购自宝生物工程(大连) 有限公司；X-Gal、IPTG、琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒和200bp DNA Marker等购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物设计与合成

依据EMBL/GenBank上公布的PPMV基因序列，针对F基因核苷酸序列两端的保守区域运用Primer premier 5.0引物设计软件设计，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，序列如下：PiU：5′-GGGCTCAGTGATGTGCTCG-3′(4 100～4 118nt)；PiD ：5′-ATATAGGTAATGAGAGCAGATGTG-3′(6 040～6 063nt)。

1.4 病毒增殖和毒力测定

每个代次均能扩繁到病毒，根据选择血凝价高且病毒稀释高的原则，每代次均选择了10-8稀释度尿囊液进行接种传代。在连续传代的过程中，病毒的血凝价从第1代次至第5代次在增加，从第5代次至第10代次之间血凝价稳定不变；MDT数值在逐渐减少；ICPI数值逐渐增加(表2)。

测定第1、5和10代次的最小致死量致死鸡胚的平均时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)。在传代同时测定MDT，能够使所有鸡胚致死的病毒的最大稀释倍数即为病毒的最小致死量(MLD)，MDT 是MLD引起鸡胚死亡的平均时间。按文献[15]的方法计算病毒的MDT(强毒株30～60 h，中等毒力 60～90 h，弱毒株>90 h)。

按文献[16]的方法计算ICPI数值，将新鲜病毒尿囊液用PBS做1∶ 10稀释，每代次毒株分别接种饲养于硬壁式负压隔离器中10只1日龄的SPF鸡，每只脑内接种 0.05 mL，同时设置10只注射PBS的对照组。每日观察1次，连续观察 8 d。每日观察发病和死亡情况，死亡计2分，发病计1分，正常计0分。ICPI=(8 d累计发病数×1+8 d累计死亡鸡数×2)/(8 d×试验鸡数)。强毒株≥1.6，中等毒株为0.8～1.5，弱毒株为0～0.5。

NDV由于缺乏高效的RNA校正酶加上病毒本身具有较高的复制效率，再加上多宿主特性和疫苗的频繁使用等因素，导致NDV自身的变异频率较高。NDV变异是一个逐步积累的过程，点突变是NDV 变异的主要方式。本研究结果是PPMV ND167在SPF鸡胚连续传代繁殖过程中获得的，免去了不同宿主体内的选择压力和免疫选择压造成的影响，推测毒力增强是由病毒自身的某些突变引起的。该研究结果不同于非鸽源NDV在鸡胚传代中毒力不变的研究。楚电峰[17]研究发现LaSota在传代过程中裂解位点氨基酸和毒力亦未发生变化。而本研究中ND167接种SPF鸡胚传代中F蛋白裂解位点氨基酸虽未突变，但出现HA升高后稳定和毒力增强，促使毒株从中等毒力株演变为强毒力株。由于ND167的HA和毒力是用鸡胚传代后在鸡体上测定的，促使病毒在鸡体中出现由不怎么适应到比较适应的能力改变。如在鸽体上测定毒力，可能就不会出现这么明显的改变，这一结果提示研究者对于PPMV毒力判定需要根据动物实验进行。

1.5 F基因RT-PCR扩增及测序

按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂使用说明书流程提取第1、5和10代次病毒全基因RNA。用GoScriptTM Reverse Transcription System进行反转录。PrimeSTAR® HS DNA Polymerase扩增F基因，PCR反应条件为：98 ℃，10 s；55 ℃，15 s；72 ℃，2 min；30个循环。利用Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR® 试剂盒连接胶回收目的片段。转化后挑取白色菌落，将菌落PCR方法鉴定为阳性的菌液送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，每个代次病毒的F基因片段至少送3个阳性克隆。

1.6 序列分析和遗传进化树分析

应用MEGA 5.03软件，将3个代次的9株PPMV F基因序列与GenBank 上已公布的NDV毒株的F基因序列进行比对分析，引用的基因序列见表1。

 

表1 本研究中引用的基因Ⅵb亚型毒株信息Table 1 Details of the subtype Ⅵb strain reference strains used in this study

  

毒株Virusstrain分离年份Yearofisolation基因型Genotype登录号Accessionnumber毒株来源Sourceofthestrain宿主Hostdove/Italy/2736/002000ⅥbAY562989意大利鸽IT⁃227/821982ⅥbAJ880277意大利鸽PPMV⁃1/NewYork/19841984ⅥbFJ410145美国鸽GB1168/841994ⅥbAF109885英国鸽HU⁃1/022002ⅥbAY190518匈牙利鸽HR⁃3/022002ⅥbAY150165匈牙利鸽HR/111/012001ⅥbAY150162匈牙利鸽AV324/961996ⅥbGQ429292爱尔兰鸽991061999ⅥbAJ306305法国鸽Macedonia/28102010ⅥbKC915212马其顿鸽Macedonia/97012012ⅥbKC915216马其顿鸽11⁃096202011ⅥbJX901124比利时鸽248VB1998ⅥbEF026583比利时鸽SE⁃10/012001ⅥbAY150161斯洛维尼亚鸡JP/Chiba/811981ⅥbAB070388日本鸡JP/Ibaraki/SM87/871987ⅥbAB853928日本鸡DK⁃6/951995ⅥbAF001130丹麦鸵鸟PB96011996ⅥbAY390291中国鸽Pi/CH/LJL/1006052010ⅥbJX486551中国鸽Pi/CH/LHLJ/1108132012ⅥbJX486553中国鸽YZ97121997ⅥbAY390288中国鸽SDLC/20112011ⅥbJQ979176中国鸽NDV05⁃0292005ⅥbFJ766528中国鸽JS/07/04/Pi2007ⅥbFJ766530中国鸽BJPI32013ⅥbKF828884中国鸽JS/07/22/Pi2007ⅥbFJ766526中国鸽

2 结果与分析

2.1 病毒增殖和毒力测定

将PPMV ND167用无菌1×PBS进行连续的10倍稀释至10-6～10-9，每一个稀释度接种5枚10日龄SPF鸡胚，每胚0.1 mL。37 ℃孵育，弃去24 h内死亡的鸡胚，之后每隔12 h观察1次，直至120 h。单胚单收测定其血凝价。采用鸡胚有限稀释法进行传代，操作方法同上。每次选择病毒稀释度最高且血凝价最高的尿囊液进行传代，共传10代次。

 

表2 ND167 3个不同代次的部分生物学测定 Table 2 Determination partial biology of ND167 3 different generations

  

生物学特性Biologicalcharacteristics代次Generation1First5Fifth10TenthHA262828MDT/h605553ICPI1．201．501．73

2.2 F基因序列的扩增

CRP电子文件是指高校从事教学、科研、管理等活动形成的文字、图表、图像、音频、视频、数据库等不同形式的电子信息记录，以及履行公共服务等职能活动在网上办事大厅通过申请、受理、办理、办结等办理事项过程中形成、获取的电子文件。高校CRP平台实现了审批事项集中进驻、网上服务集中提供、数据资源集中共享。但是，CRP平台毕竟只是一个集成的业务系统，它只关注于业务的形成和办理，对于办理完毕的电子文件的凭证价值、归档保存和安全利用等问题并未做重点关注，随着高校CRP平台建设的全面推进，产生的电子文件越来越多，电子文件的归档问题越来越凸显。

2.3 F基因序列和遗传进化树分析

测序结果表明，F0蛋白裂解区域的氨基酸序列均为112RRQKRF117，为典型的强毒株裂解位点。ND167-5-3 第25位氨基酸残基由C突变为R，ND167-10-1 第87位氨基酸残基由T突变为P，ND167-5-2 第131位氨基酸残基由T突变为A，ND167-5-1 第356位氨基酸残基由S突变为P。

  

注：1，2，3分别为ND167-1-1，ND167-1-2， ND167-1-3；4，5，6 分别为ND167-5-1，ND167-5-2，ND167-5-3；7，8，9分别为 ND167-10-1，ND167-10-2和ND167-10-3。 Note: Lane 1,2 and 3 were ND167-1-1,ND167-1-2 and ND167-1-3 respectively,lane 4,5 and 6 were ND167-5-1,ND167-5-2 and ND167-5-3,respectively,lane 7,8 and 9 were ND167-10-1, ND167-10-2 and ND167-10-3,respectively.

 

图1 菌落PCR鉴定结果 Fig.1 The identification results of colony PCR

应用Lasergene 7.0软件对9株测序基因和从EMBL/GenBank选取的53株代表性毒株的F基因(47～420 nt)进行比较，其中包括26株基因Ⅵb亚型毒株，据此绘制了系统进化树。遗传进化树见图2。

  

图2 根据F基因47～420 nt核苷酸绘制的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of partial F gene (between nt 47 and 420)

3 讨论

从操控布局来看，尼康D500完美继承了全画幅旗舰机型D5的结构，拥有众多的实体按键/拨盘，包括白平衡、图片质量、测光模式等众多功能都有其专用按键，只需配合前拨盘就可以进行相应设置，熟练后可进行盲操。对于注重连拍性能的机型来说，连拍模式转盘是必不可少的，在D500上自然没有缺失。在机身背部，能够将激活对焦功能和快门释放区分开，对于体育题材摄影师十分重要的AF-On键以及方便移动对焦点的摇杆也都在最容易接触到的位置上。

寒潮天气过程是一种大规模的强冷空气活动过程,寒潮天气的主要特点是剧烈降温和大风,其中较易出灾且难防范的就是大风过程。

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行处理，计数资料以百分数（%）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

参考文献：

研究人员通过动物接种试验证实了NDV弱毒可以演化为强毒。于圣青等[18]将鹅源NDV通过连续9次鸡气囊接种传代后再进行5次脑内接种传代，尽管 F蛋白裂解位点的突变情况未出现，但致病性却随着病毒在脑内传代而增强。DORTMANS等[19]将PPMV AV324/96在鸡脑内传代5个代次后发现F蛋白裂解位点氨基酸未发生变化，但是ICPI由0.44升至0.90。通过反向遗传技术将其与Herts/33进行了NP、P、M和L基因进行单基因和多基因替换，发现NP、P和L 3个基因可显著影响毒力。本研究中暂未涉及NP、P和L 3个基因序列研究，需要后续试验进行验证。

研究发现，一般对鸡表现为中等毒力的PPMV分离株的强弱毒株并不完全符合这一特点，有部分强弱毒株在此区域序列是相同的[20]。因此，PPMV的毒力与根据F蛋白裂解位点序列特征判定的毒力结果有一定偏差，这在一定程度上表明PPMV毒力的特殊性[13-14]。研究表明，虽然基因Ⅵb亚型NDV 对鸽的致病性没有基因Ⅶd 亚型强，但是其感染鸽后的病毒载量和带毒排毒时间均大于基因Ⅶd亚型病毒，这从另一侧面说明基因Ⅵb 亚型病毒对鸽的特殊嗜性。吴双等[21]将基因Ⅲ、Ⅵb、Ⅶd和Ⅺ 4种基因型的NDV在美国白羽王鸽体中进行致病性试验，结果表明基因Ⅵb亚型 NDV感染鸽后，体内带毒时间最长，排毒量亦明显高于其他基因型。由此可见，基因Ⅵb亚型 NDV对鸽的危害性最大。综上所述，PPMV对鸡群存在潜在的巨大风险，需警惕PPMV在鸡群中反复传代毒力增强，因此要将鸽群和鸡群严格隔离饲养。

F蛋白裂解位点氨基酸基序(112～117 aa)是NDV毒力的主要决定因素，大多数NDV 毒株F蛋白氨基酸的变异都集中在信号肽区(1～25 aa)内。本研究中F蛋白的裂解区域氨基酸没有发生改变。9个推导的F蛋白共有4个氨基酸发生突变，由于测序基因数量的限制，经比对并未发现点突变具有规律性。其中，第25位氨基酸残位于F蛋白第一个疏水区即N端信号肽区；第87位和131位氨基酸残基位于F蛋白第二个疏水区，该区为融合诱导区；此外第87aa亦是糖基化位点。

[1] MILLER P J,DECANINI E L,AFONSO C L.Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges [J].Infect Genet Evol,2010,10(1):26-35.

[2] ALEXANDER D J,PARSONS G.Pathogenicity for chickens of avian paramyxovirus type 1 isolates obtained from pigeons in Great Britain during 1983 to 1985[J].Avian Pathology,1986,15(3):487-493.

[6] LIU X F,WAN H Q,NI X X,et al.Pathotypical and genotypical characterization of strains of Newcastle disease virus isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985 to 2001[J].Arch Virol,2003,148(7):1387-1403.

[3] KALETA E F,ALEXANDER D J,RUSSELL P H.The first isolation of the avian PMV-1 virus responsible for the current panzootic in pigeons?[J].Avian Pathol,1985,14(4):553-557.

[4] ALEXANDER D J,RUSSELL P H,PARSONS G,et al.Antigenic and biological characterization of paramyxovirus type 1 isolates from pigeons an international collaborative study [J].Avian Pathol,1985,14(3):365-376.

辣椒不仅是良好的调味品，还具有很高的营养价值和药用价值。辣椒中维生素C的含量在蔬菜中居第一位。辣椒营养又防病，被称为“红色药材”[1]。

[5] DORTMANS J C,ROTTIER P J,KOCH G,et al.Passaging of a Newcastle disease virus pigeon variant in chickens results in selection of viruses with mutations in the polymerase complex enhancing virus replication and virulence[J].J Gen Virol, 2011,92(2):336-345.

还应当看到，人类命运共同体作为一种新思想新理念新实践，还处在不断丰富发展阶段，至少在以下几个方面需要进一步拓展。

椰果的采摘是一个季节性较强和劳动密集型的工作，由于农村剩余劳动力越来越少和农业生产经营模式等因素的限制，与发达国家农业机械化水平相比，我国实现农业机械化水平还比较低。所以，在单调、繁重、危险的椰果采摘作业上急需高效、通用、低成本的采摘技术。农业机械化是生产发展的主要物资装备，没有农业机械化就不可能有农业的现代化、产业化。在政府的大力支持下，海南椰子种植业得到了较快发展，椰果产量也在逐年提高，而椰果采摘机的使用能大大提高椰子的采收效率，促进海南椰子产业化发展。

[7] LIU H,WANG Z,SON C,et al.Characterization of pigeon-origin Newcastle disease virus isolated in China[J].Avian Dis,2007,50(4):636-640.

[8] GUO H,LIU X,HAN Z,et al.Phylogenetic analysis and comparison of eight strains of pigeon paramyxovirus type 1 (PPMV-1) isolated in China between 2010 and 2012 [J].Arch Virol,2013,158(6):1121-1131.

[9] LEEUW O S,KOCH G,HARTOG L,et al.Virulence of Newcastle disease virus is determined by the cleavage site of the fusion protein and by both the stem region and globular head of the haemagglutinin-neuraminidase protein [J].The Journal of general virology,2005,86(6):1759-1769.

[10] ROMER-OBERDORFER A,VEITS J,WERNER O,et al.Enhancement of pathogenicity of Newcastle disease virus by alteration of specific amino acid residues in the surface glycoproteins F and HN [J].Avian Dis,2006,50(2):259-63.

[11] PANDA A,HUANG Z,ELANKUMARAN S,et al.Role of fusion protein cleavage site in the virulence of Newcastle disease virus [J].Microb Pathog,2004,36(1):1-10.

[12] COLLINS M S,STRONG I,ALEXANDER D J.Pathogenicity and phylogenetic evaluation of the variant Newcastle disease viruses termed ‘pigeon PMV-1’ viruses based on the nucleotide sequence of the fusion protein gene [J].Arch Virol,1996,141(3):635-647.

[13] 王伟伟,江苏省新城疫病毒分子流行病学研究及鸽源分离株基因组序列的分析[D].扬州: 扬州大学,2009.

用上述引物通过菌落PCR方法扩增得到的片段与预期片段大小一致，3个代次9株菌液均扩增到目的片段。具体结果见图1。

[14] DORTMANS J C,KOCH G,ROTTIER P J,et al.Virulence of pigeon paramyxovirus type 1 does not always correlate with the cleavability of its fusion protein [J].J Gen Virol,2009,90(11):2746-2750.

[15] YOSHIMURA M,TSUBAKI S,YAMAGAMI T,et al.The effectiveness of immunization to Newcastle disease,avian infectious bronchitis and avian infectious coryza with inactivated combined vaccines[J].The Kitasato archives of experimental medicine,1972,45(3):165-179.

[16] 世界动物卫生组织.哺乳动物、禽类和蜜蜂A类和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册[M].农业部畜牧兽医局译，北京: 中国农业科技出版社,1996.

[17] 楚电峰.新城疫病毒LaSota株的纯化和免疫原性分析[D].扬州: 扬州大学,2009.

薪酬问题的核心是公平问题，包括外部公平和内部公平，公务员薪酬市场化，是指公务员薪酬的水平要以市场为标准，不能过高或过低。本文主要讨论的是公务员薪酬与市场其他行业人员薪酬之间的公平问题，即外部公平。

[18] 于圣青,丁铲,NORIKO K,等.新城疫病毒某水禽分离株经鸡体传代后由非致病型转变为速发型的研究[J].中国预防兽医学报,2003,25(1):59-64.

[19] DORTMANS J C,ROTTER P J,KOCH G,et al.The viral replication complex is associated with the virulence of Newcastle disease virus [J].J Virol,2010,84(19):10113-10120.

UPLC-Q-TOF-MS法分析苗药黑骨藤提取物中的化学成分…………………………………………………… 覃小丽等（21）：2949

[20] 郭虹波.鸽源禽I型副粘病毒分离鉴定、基因组特性分析及致病性研究[D].哈尔滨:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,2013.

[21] 吴双,王伟伟,曹军平,等.不同基因型新城疫病毒对美国白羽王鸽的致病性研究[J].中国预防兽医学报,2010,32(6):424-427.