玉米子粒灌浆突变体候选基因的精细定位

玉米子粒干物质积累是一个连续的生物学过程，涉及一系列复杂的生理生化代谢机制[1]。玉米授粉后15～40 d是子粒光合产物的快速积累期，子粒90%的干物质来源于这一时期，该时期决定着一个玉米品种的产量水平。灌浆是光合产物从叶肉细胞经韧皮部运输到子粒并积累的过程，胚和胚乳的发育与灌浆过程密切相关[2]。解析玉米子粒灌浆的遗传机制，克隆影响子粒灌浆的关键基因，可以为玉米产量性状的遗传改良提供理论依据。 前人利用突变体相继克隆了控制子粒大小的mn1(miniature)，smk1(samll kernel)，smk2和弱势灌浆的emp1(empty pericarp)， emp2，emp3，emp4，emp5，emp6，emp10，emp11，emp16等关键基因，并对其分子机制进行了深入研究。mn1(INCW2)基因编码细胞壁蔗糖转化酶，在胚乳基部1/3处和花梗区域调控光合产物的运输[3]。该基因突变导致基部胚乳转换层细胞内增长欠缺，蔗糖转化受阻，子粒灌浆不充分[4-5]。ZmSWEET4c基因作用于mn1基因的下游，调控基部胚乳转化层细胞内的己糖向胚乳细胞转运，其突变导致子粒灌浆差[6]。smk1基因参与线粒体nad7转录本的编辑，编码一个线粒体E型的三角状五肽重复(pentatricopeptide repeat, PPR)蛋白，该基因失去功能会使nad7-836位点的C-to-U的编辑消失，对应的氨基酸NAD7-279由亮氨酸变成脯氨酸，线粒体复合物I的组装量和NADH脱氢酶活性也显著减少，抑制玉米种子胚和胚乳的发育[7]。smk2基因编码参与维生素B6生物合成的PLP合酶复合物的谷氨酰胺酶亚基，在突变体的胚和胚乳中，B6维生素的代谢物PLP显著降低，导致胚胎致死[8]。在子粒弱势灌浆研究中，emp2基因编码热激响应的负调控因子——热激结合蛋白1(Heat shock factor binding protein-1, HSBP1)，调控玉米胚的生长发育[9]。emp4基因和emp5基因编码线粒体三角状五肽重复(PPR)蛋白，emp4基因影响胚乳线粒体转录本的准确剪切，emp5基因影响线粒体转录后的翻译 [10-11]。emp6基因编码线粒体植物器官RNA识别结构域蛋白(Protein-RNA recognition, PORR)，参与II类内含子的剪接，该基因突变导致玉米子粒过早停止发育[12]。emp10,emp16和emp11均编码PPR蛋白[13-15]。emp10[13] 和emp16[14]基因的突变分别影响线粒体基因nad2第1和第4个内含子的正常剪切，而emp11基因的突变影响线粒体基因nad1的剪切[15]。这3个基因均影响线粒体复合体1的组装，任何1个基因的突变都会抑制胚和胚乳的正常发育。 在子粒发育与灌浆研究中所利用的突变体多数表现为子粒发育不良、植株矮小等性状。河南农业大学玉米生物技术团队在育种过程中发现了1个自然突变体M 72。该突变体表现子粒灌浆极差，胚乳淀粉积累少，但是植株高度正常，能正常散粉，是一个新的突变类型。本研究对其进行了初步定位和精细定位，并利用生物信息学的方法对目标区域内的候选基因进行了预测，为进一步基因克隆和功能验证奠定了研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用材料是在育种过程中发现的一个玉米自然突变材料M 72(图1A)。该突变体表现为子粒干瘪、胚乳灌浆差、淀粉充实明显不足，成苗率低，但成株可正常散粉结实。2013年夏在河南农业大学科教园区以M 72为父本，正常自交系B 73为母本杂交的F1果穗上子粒灌浆正常，F2果穗上的子粒出现分离。2014年夏在郑州和2014年冬在海南分别组配了F2分离群体和BC1分离群体，分别用于目标基因的初步定位和精细定位。M 72，B 73，BC1与F2果穗的子粒表现见图1-B。

  

图1 突变体M 72及其野生型果穗和子粒表型Fig.1 The performance of kernel and ear of mutant M 72 and its wild type

1.2 DNA提取和标记分析

利用改良的CTAB法分别提取M 72，B 73和F2分离群体的单株DNA[16]，BC1分离群体交换单株筛选采用碱煮法提取胚乳DNA [17]。将F2群体中的15个正常子粒和15个弱势灌浆子粒的DNA等量混合分别构建显性基因池和隐性基因池[18]，利用均匀覆盖玉米基因组10条染色体的800对SSR引物(http://www.maizegdb.org)，分别对亲本和池进行多态性分析，筛选可能与目的基因连锁的SSR标记，并利用分离群体进行验证。在目标基因两侧连锁标记区域内进一步开发新的标记，通过交换单株的基因型分析，逐步缩小目标基因的定位区间。在对目标基因进行初步定位的基础上，利用目标基因两侧紧密连锁的SSR标记对BC1分离群体的3.2万粒正常子粒筛选交换单株，交换单株的子粒用3% 的H2O2处理15 min，以提高其成活率，通过育苗移栽提高其成株率，交换单株在田间人工授粉自交。根据果穗子粒分离情况确定其基因型。

1.3 标记开发

以玉米自交系B 73序列为参考(http://www.maizegdb.org) ，对目标基因初步定位标记的B 73序列进行Blastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析，获得相应的单拷贝序列，并利用SSRHunter软件查找简单重复序列区段；进一步利用primer premier 5.0软件设计SSR引物，引物设计的原则为PCR产物长度100～250 bp，GC含量为40%～60%，引物无错配，引物3’端无发夹结构，退火温度为55～62 ℃，引物长度18～22 bp。部分引物的设计结果见表1。

 

表1 多态性标记信息Table 1 The information of polymorphic markers

  

引物Primer正向引物序列Forwardprimer反向引物序列Reverseprimer8．30⁃6TTCCCGATGGAGACGCATGCCCTTGGCTTATCAGTCA5．28⁃9ATGGTGCCTTCTCGTCGGGCCCACTGTCGTTGCTCG5．28⁃11GCCCTGTGCGTTTCTCTCTATGGCTGAATGTCCTGTTGC5．28⁃12TTCTCTTGTAGTGGTGTTCTTCCTACGGCGGCTCAAAAAATA5．28⁃13CTTTGAGCCGACAAGAGTGGGCTGGTCCGACGAGACATAG5．28⁃25CGAAACAGGCTGAACTAAACAATGAACCAGAACCACCCGAC5．28⁃27ATGGTGCCTTCTCGTCGGCGCCCACTGTCGTTGCT5．28⁃28GAGGGGGTGAGTGAAAATGGGAGCCGCACGACAAGGA5．28⁃29AGCGTGTCGTCGTTCTCAAAAAGCAGCAATGGCGGA5．28⁃31TGGCAATGGAAGTGGTGAAGGTCCGACGAGACATAGATACAGqb⁃6ATCGGAGGGAGGTGAGCATGGACGGTTGGATGGAGCqb⁃19ATCACAGTTTGCGACGGAAGGCTAACAGCAGCAGGCAGAAT6．11⁃16GTGCTTTCTTCCTTCCCCAGCTTCCAACCAGGTGATGC6．11⁃19AGACTTCTGCTTCGGGTTTATGGTGTTTTCATCCTTTTGCC12．22⁃63TTGGGTATAGGAGGCCTGCTCCCACCGCTCTCATCTCATC12．22⁃75ACCCTCAAGTCCTCACATGAGCTCTGGCTTGCGACTAGAT12．22⁃106AAGCAAAACCACACATCGCGCCCAAGAGGACGAGATGCTC6．26⁃44GCTGCACCAAAAGCTCGATTGGGCGTCATTGGTTTGTGTG6．26⁃62TCAACTCTGGATCAACTGTCCAACTCATCATGCCGCTCACTT

2 结果与分析

2.1 子粒灌浆突变体的遗传分析

M 72与B 73杂交的F1果穗子粒正常，F2分离群体的分离果穗上正常子粒与突变子粒表现为典型的3∶ 1分离(表2 )。选择2个F2果穗上的400个正常子粒在田间种植，并进行人工授粉自交，其中138个单株的果穗子粒正常，262个单株的自交果穗子粒出现分离，符合1∶ 2的分离比例(表3)，且每个分离果穗上正常子粒与灌浆突变子粒的分离比例符合3∶ 1(单个果穗上正常子粒314粒，突变子粒94粒)(表2)。140个BC1分离群体的果穗子粒均符合正常子粒与突变子粒1∶ 1的分离规律(单个果穗上正常子粒204粒，突变子粒192粒)(表2 )，同时从BC1果穗上的灌浆正常子粒中随机挑选500粒，种植后自交果穗均表现正常子粒与突变子粒3∶ 1的分离(单个果穗上正常子粒307粒，突变子粒118粒)(表2)。可见，突变体M 72由1对隐性基因控制，将该基因命名为emp20。

 

表2 F2，F3，BC1和BC1F2果穗子粒的分离情况 Table 2 The kernels segregation of F2，F3，BC1 and BC1F2 population

  

材料Material子粒总数Kerneltotal正常子粒Normalkernels突变子粒Mutantkernels实际比值Actualratio理论比值Theoreticalratioχ2检验χ2testF2387296913．25∶13∶10．48F3408314943．34∶13∶10．84BC13962041921．06∶11∶10．26BC1F24253071182．60∶13∶11．73

 

表3 F3群体果穗的分离情况 Table 3 The ear segregation of F3 population

  

总穗数Totalear正常果穗Normalear分离果穗Separateear实际比值Actualratio理论比值Theoreticalratioχ2检验χ2test4001382621∶1．91∶20．28

注：

 

2.2 子粒灌浆突变体基因emp20的初步定位

通过BSA分析，在玉米第2染色体上的bin2.04发现SSR引物umc1448,umc1485,umc2252,umc1065和umc2220在亲本和2个池之间存在多态性(图2)。利用这些多态性标记对400个F2群体的单株基因型进行分析(图3)，将emp20的候选基因定位于SSR标记umc1485和umc2252之间(图4)。进一步在2个标记之间开发了253对SSR标记，并利用其中的8对多态性标记对56个交换单株进行基因型分析，将目标基因定位在SSR标记umc1485和6.11～16的3.2 Mb的物理距离内。

  

从左到右依次是B 73，M 72，显性池，隐性池。 From left to right are B 73, M 72, dominant pool , recessive pool.

 

图2 在亲本和BSA分池之间存在多态性的标记 Fig.2 The markers displaying polymorphism in parents and BSAs

由于突变体M 72的纯合基因型种子具有发芽率低、不易成活的特点，为提高交换单株的田间成活率，在实验室利用碱煮法提取了3.2万粒BC1分离群体的正常子粒胚乳DNA。利用目的基因两侧标记umc1448和umc2252对BC1分离群体进行了交换单株的基因型分析，共筛选到1 270个交换子粒，将交换子粒通过育苗移栽，得到1 083个子粒表型确定的交换单株。利用目标区段内新开发的19对与目的基因紧密连锁的多态性标记(表1)对1 083个交换单株进行分析，最终将目的基因定位在标记12.22-63和标记8306之间135.6 kb的物理距离内(图5)。

上了年纪的人，诸如周老相公这样的更加如此。一跟外乡人吵架无非就是几句话，先问是谁先动的手，如果是我们岭北人先动的手，毫无疑问是我们的错。如果是对方先动的手，那就说，人家是个外地人，到我们岭北来讨生活，多不容易啊，得饶人处且饶人吧。就这样，现在有些外乡人都骑到我们头上来撒尿了。

  

A:标记umc1448在F2群体中的基因型分析; B:标记umc2252在F2群体中的基因型分析。

 

A: Genotype analysis of umc1448 in F2 population; B: Genotype analysis of umc2252 in F2 population.

 

图3 部分标记在F2群体中的基因型分析 Fig.3 Genotype analysis of partial markers in F2 population

  

图4 emp20基因的初步定位Fig.4 The location of the emp20 gene

  

图5 emp20候选基因的精细定位Fig.5 Fine mapping of the candidate gene for mutant emp20

2.3 候选基因的预测

中金公司的数据表明：以中美之间贸易量占全球的比例来看，中美之间集装箱贸易占全球4.7%，粮食贸易占全球7.8%，是占比最高的两个子类。从双方的依赖度而言，中国从美国进口占比高的主要为粮食（包括大豆），占中国粮食进口量的34.4%；美国从中国进口占比高的主要为集装箱，占美国集装箱进口量的37.4%。

03778(表4)，其中Zm00001d00377编码一种具有FAF结构域的蛋白，FAF是一个调节茎尖分生组织的蛋白家族；Zm00001d003778编码一种具有MdiB结构域的ABC跨膜转运蛋白，Zm00001d003776编码一种细胞壁蔗糖转化酶。MaizeGDB(https://www.maizegdb.org/gene_center/gene)中，3个基因的表达谱结果分析表明，Zm0001d003776基因在授粉后8～12 d的胚乳中特异表达，Zm0001d003777基因在雄花中特异表达，而在胚乳中不表达，Zm0001d003778基因则是组成型表达基因。

 

表4 候选基因预测结果Table 4 The information of the candidate genes

  

基因编号Genenumber名称Name物理位置PhysicalpositionGo注释GonotationZm00001d003776Miniatureseed158876332⁃58879327GlycosylhydrolasesputativeexpressedDAP12胚乳与子粒中表达Zm00001d003777UncharacterizedproteinLOC10050228558952930⁃58953334Unknown雄花中表达Zm00001d003778ABCtransporterBfamilymember29，chloroplastic58999294⁃59005449ABCtransmembranetransporterdomaincontainingproteinexpressed16DAP后的胚乳中表达

3 结论与讨论

通过对发现的玉米胚乳缺陷型突变体遗传分析，本研究发现其有1个隐性基因控制。利用BSA分池结合交换单株筛选对发现突变体emp20的候选基因进行了精细定位。根据B73的基因组序列信息预测目标区域内包含3个候选基因，为进一步解析目标性状的遗传机制奠定了基础。

通过对3支超导铌腔的EP试验数据进行跟踪汇总，可以看出以上三种方法得出的去除厚度结果基本一致。但是，由于EP后要进行脱硫清洗、高压水冲洗等洁净化操作，EP后称重可能会对腔体造成二次污染，所以，不建议选用此方法。使用超声波测厚仪测量EP前后的壁厚，然后计算EP去除厚度的方法在EP过程中可以辅助理论跟踪计算验证去除厚度，单独使用可靠性差，因为超导铌腔赤道处相对束管和IRIS处曲率半径较小，所以就微米级的去除厚度来说，测量过程中误差较大。综上，理论跟踪计算方法是最为直接、可靠的一种方法。

就这样，二人稀里糊涂地交往了两年之久。转眼间，到了杨力生三十四岁这年的深秋，阵阵凉风吹来，摧枯了漫山遍野的花草，染黄了树木的叶子。这天，杨力生又约李秀花到村边的小树林里见面，二人拥抱了一会儿，亲热话说上一大堆，杨力生因想娶李秀花的想法心切，便说：

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种子的大小与质量是玉米产量的最终体现者，而光合产物的积累则是种子形成的能量与物质基础。玉米是典型的单子叶植物，其种子由胚和胚乳组成，其中胚乳是光合产物积累的主要器官，占种子质量的70%左右，因此，解析胚乳营养物质积累的分子机制，对优良玉米新品种的选育具有重要意义。突变体的筛选与鉴定是克隆控制目标性状关键基因的最有效方法之一，前人以不同的突变体为材料对玉米子粒胚和胚乳构成与发育的关键基因进行了克隆[6-16]，这些基因多数与光合产物的运输以及线粒体基因的编辑有关。但是，由于子粒发育与灌浆过程的复杂性，人们对其形成的分子机制和代谢仍知之甚少，需要进一步解析其代谢调控网络。

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诸暨市在建设大调解体系方面的探索与创新，是新时代“枫桥经验”的延伸与拓展，也为新时代多元化纠纷解决机制的丰富和发展提供了助力。“枫桥式” 大调解体系建设的启示与借鉴意义有如下几点。

本研究对弱势子粒灌浆突变体M 72的候选基因进行了精细定位，通过与B 73参考基因组进行比较分析，发现在目标区域内只有3个候选基因。前人曾经通过玉米不同组织和部位样品的RNA-seq，对预测的玉米基因表达规律进行了分析(www.maizegdb.org)，在已有的预测结果中，Zm00001d003777仅在玉米的雄花中特异性表达，而在胚乳中不表达；Zm00001d003778在胚乳中表达；Zm00001d003776是已知的mn1基因，在授粉后8～12 d的胚乳中特异表达，该基因突变导致蔗糖转化受阻，子粒灌浆不足，粒重降低[4-5]。M 72突变体的子粒表型与mn1突变体相似，胚和胚乳的发育受阻，子粒干瘪易碎，发芽率低，千粒重仅有野生型的30%左右，因此，Zm00001d003776(mn1)可能是突变体emp20的候选基因。由于不同玉米自交系的基因组存在广泛的遗传变异，不同基因型的自交系之间基因存在大量的差异，故需要利用突变体emp20与mn1进行等位性测验以确定2个突变体基因的差异，为进一步开展后续功能验证提供有效的证据。

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利用生物信息学分析方法，对候选区段的序列进行基因预测(http://ensembl.gramene.org)(表4)。结果表明，该区段内存在3个开放阅读框，即Zm00001d003776, Zm00001d00377和Zm00001d0

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计算出d(Ei,Ej)后，再计算两证据之间的相似度Sij=1-d(Ei,Ej)(i,j=0,1,2，…，k)，得到相似度矩阵S。

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因为缺乏直接的证据，罗恬只在警局里关了一天，就被放了出来。可罗恬不想再住进那幢房子了，她准备收拾一下东西，出去散散心。 可是一进门，罗恬就看见了陈洋：“你怎么也回来了？”

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对外商投资的优惠政策向银发产业倾斜，为外商投资银发产业创造具有吸引力的政策环境。例如对外商直接投资我国银发产业提供优惠的税收政策和部分费用减免政策。简化外商投资我国银发产业的行政审批程序。特别是对老年服务业领域，放宽对外资投入的监管，逐步开放某些不透明、不公开的垄断行业。对外商投资我国老年服务行业在地租减免、银行贷款等方面给予一定的扶持。通过各项措施引导外商投资我国银发产业中较为薄弱的领域。

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