微流控技术检测宫颈脱落细胞HPV的临床应用

临床实验室常用于检测HPV的筛查方法是液基细胞学检测和HPV核酸检测。已有许多文献[1-3]报道基于HPV基因检测方法的敏感性优于细胞学筛查。HPV基因检测方法多样，常见的有杂交捕获法、膜杂交法、荧光定量聚合酶链反应（fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR）法以及mRNA检测法等。有4种方法已获FDA批准，分别是第二代杂交捕获法（HC2，凯杰）、荧光PCR法（Cobas，罗氏）、酶切信号放大法（Cervista，豪洛捷）、mRNA检测法（Aptima，豪洛捷）。有些方法不能识别HPV基因型别，需要专业人员以及昂贵的仪器设备支持，这些因素限制了这些分子诊断方法的应用。

博晖微流控法是基于微流控技术来实现HPV基因及其型别的检测。微流控技术[4]是利用层压原理将所有的泵、阀门、微通道和反应池都集成到一次性塑料模块中，所有实验步骤（包括细胞裂解、核酸提取纯化、多重PCR和膜杂交）以及结果分析都是在这个密闭的一次性芯片中自动完成。它能检测和识别17个高危型（16, 18, 31, 33, 35, 39,51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82, 83）和7个低危型（6, 11,42, 43, 44, 45, 81）HPV型别。本研究的目的是验证博晖微流控HPV全自动核酸检测法检查女性宫颈脱落上皮细胞样本HPV及其型别的性能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本 收集2016年8月-2016年11月在中山大学附属第八医院（深圳福田）参与日常体检的224例宫颈脱落细胞，储存于宫颈细胞脱落采集器中，且每例样本不少于2 mL，这些样本一部分被用于亚能膜杂交法检测，留取一部分储藏在-20oC的低温冰箱中。

1.1.2 仪器和试剂 Hema 9600 PCR仪（珠海黑马医学公司），YN-H16恒温分子杂交仪、脱色摇床、宫颈细胞脱落采集器、人乳头瘤病毒基因分型（23型）检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）购自深圳亚能生物技术公司，台式高速离心机（美国Labnet公司）。24型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒（生物芯片法）、Encompass MDxTM、6种（HPV6, 16, 18,31, 42, 52）质粒（1.0E7 copies/mL）均购自北京博晖创新光电技术股份有限公司。HPV 27全分型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒（流式荧光杂交法）（上海透景生命科技股份有限公司）。Luminex 200（美国Luminex公司）。

2.1 样本结果 在224例标本中，膜杂交法检测出99例阳性样本（78例单基因型和21例二重或多重基因型），125例阴性。博晖微流控法检测出92例阳性（75例单基因型和16例二重或多重基因型），阴性132例。

1.2.3 流式荧光杂交法 采用通用引物多重PCR扩增，流式荧光杂交分型检测的方法，同时检测27种HPV DNA型别（HPV16, 26, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66,68, 82, 6, 11, 40, 42, 43, 44, 55, 61, 81, 83）。流式荧光杂交法按透景试剂盒说明操作，手工提取HPV DNA和PCR扩增。Luminex200检测结束后，软件会自动生成excel结果文档。打开透景科技3.2计算软件自动判读样本检测结果。

2.2 批间精密度实验和灵敏度验证 把4例样本在同一天内由博晖微流控法重复检测3次，得到12个检测结果，3次重复检测结果均一致，认为该方法的批间精密度为100%。把6个HPV基因型别（HPV6, 16, 18, 31, 42, 52）的质粒（1.0E7 copies/mL）依次稀释100倍、1,000倍、10,000倍、100,000倍，由博晖微流控HPV法检测到最低浓度即为其检测限。当质粒HPV16, 6, 42, 52稀释到1.0E2 copies/mL时，仍可检测出其基因。而质粒HPV18, 31在稀释到1.0E3 copies/mL可显示检测到其基因，但稀释到1.0E2 copies/mL时，膜条斑点无显色。这表明博晖微流控法对某些基因型的检测限为1.0E3 copies/mL，而某些为1.0E2 copies/mL甚至更低，其灵敏度有基因型别差异。

1.2.1 亚能膜杂交法（又称为亚能PCR-反向点杂交法） 利用HPV的基因特点设计特异引物，扩增23种HPV基因型的目的片段（HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58,59, 66, 68, 73, 82, 83; HPV6, 11, 42, 43, 81），将扩增产物与固定在膜条上的包括18种高危型和5种低危型在内的分型探针进行杂交，依据杂交信号的有无判断各HPV基因型的存在。为了消除临床检验的假阴性，本方法以特异性引物扩展人类看家基因β-actin，做为内控（internal control,IC）。亚能膜杂交法按试剂说明书人工提取HPV DNA、PCR扩增、杂交显色。肉眼观察结果，阴性质控品的杂交膜条除IC位点有显色信号（蓝色斑点）外，其他位点均不应显色，否则提示实验可能发生污染。阳性质控必须在相应的HPV基因型位点及IC位点出现显色信号，否则说明实验失败，提示PCR扩增或杂交失败。依据斑点显现的有无和蓝色斑点、显现的位置即可判断样本是否含有HPV基因及其基因型。

虽然博晖微流控法的敏感性95.70%（89.35%-98.82%）比膜杂交法敏感性100%（96.11%-100.00%）稍低，但其特异性98.47%（94.59%-99.81%）比PCR-反向点杂交检测法特异性95.42%（90.30%-98.30%）稍微高点。博晖微流控法批间精密度研究中，3次重复检测结果100%一致，说明此方法结果重复性好且稳定。博晖微流控法灵敏度检测结果显示，对HPV不同型别的检测限不同。

膜杂交检测法比博晖微流控检测法检出HPV基因多。其原因可能有：（1）与样本量关，膜杂交法所需样本量比博晖微流控法大；（2）膜杂交法中许多膜条混在一起杂交、洗涤、显色，这可能导致交叉污染；（3）多重基因型感染中由于各基因型别浓度不同、引物特异性差异，可能会互相抑制竞争。

CDFU是将旋流离心分离技术、高效溶气技术、气浮分离技术有机结合于一体，对含油、含悬浮物污水进行高效分离的一种混合型装置[6-13]，如图4所示。通过旋流和大量超微气泡的综合作用，极大地提高气泡浮选的效果，缩短气浮停留时间，实现高效、快速除油。

1.3 统计学分析 亚能膜杂交法和博晖微流控法的敏感性、特异性及其95%置信区间（confidence intervals, CIs）是由结果判定标准而决定的。两者结果不一致时，则有流式荧光杂交法确定。如果单基因型的亚能和博晖结果不同，则以流式荧光杂交法结果为准；若二重基因型（检测出两种基因型）和/或多重基因型（3种或3种以上基因型）结果不一致，则以3种方法中检测出最匹配结果作为最终结果（若3种方法任意一种方法只检测出其中一种基因型，也可认为结果一致）。由于以上HPV44, 26, 55和HPV61基因型不是3种共同能检测到的型别，故检测到以上基因型的型别均视为阴性结果。所有数据统计分析利用MedCalc®version 15.2 statistical software完成。

2 结果

1.2 方法

在博晖微流控法的132例阴性结果中，膜杂交法检测到122例阴性、9例单基因型以及1例多重基因型；在9例单基因型样本中，再由流式荧光杂交法检测，结果有5例为阴性，4例与膜杂交法检测一致。对于这例膜交法结果为多重基因型的标本，流式荧光杂交法检测为阴性。在75例博晖微流控法单基因型的样本中，与膜杂交法结果完全符合的有66例。在9个结果不符的样本中，有6例膜杂交法结果为二重基因型，而流式荧光杂交法有3例与膜杂交法结果一致，3例与博晖微流控法结果相符；还有1例膜杂交结果为多重基因型，流式荧光杂交法与博晖微流控法结果均为阴性。其他2例中，1例博晖微流控法为HPV18型，而膜杂交法为阴性，流式荧光杂交法为阴性；还有1例样本的3种检测方法结果完全不同，博晖检测结果为HPV44，而膜杂交和流式荧光杂交法分别为阴性和HPV55，根据结果判读标准，3种检测方法结果均为阴性。博晖微流控法11例二重基因型样本中，有2例基因型分别为HPV44, 81和HPV44, 59，根据评判标准认为这2例为单基因型HPV81和HPV59。有4例样本和膜杂交检测法结果完全一致；有2例膜杂交为单基因型，流式荧光杂交法和膜杂交结果一致。有3例膜杂交检测法结果为多重基因型，而流式荧光杂交法有2例和博晖微流控法结果一样，1例为单基因型。在6例博晖微流控法多重基因型的样本中，有4例样本与膜杂交检结果一致，1例样本的其他两种方法结果均为阴性。还有1例博晖微流控法结果为HPV16, 51, 44，根据评判标准，此结果视为HPV16, 51，而其他两种方法检测结果为HPV11, 16,51。基于结果评判标准，博晖微流控HPV全自动核酸检测法和膜杂交检测法的敏感性和特异性及其95%CI分别为95.70%（89.35%-98.82%）、98.47%（94.59%-99.81%）和100%（96.11%-100.00%）、95.42%（90.30%-98.30%），见表2。

1.2.2 博晖微流控法 多重PCR扩增基因和膜杂交显色检测24种HPV基因型（16, 18, 31, 33, 35, 39, 51, 52, 53, 56, 58,59, 66, 68, 73, 82, 83, 6, 11, 42, 43, 44, 45, 81）。博晖微流控法按操作系统要求操作：启动Encompass MDxTM用户操作软件，检查耗材及安装芯片，加样，点击操作软件中的“Start HPV Run”运行检测。结果由软件系统判读。结果判读参照膜条表1。阳性判读：内参质控点（GB）、表面化学修饰质控点（SP）和阳性点都显色，则结果可靠。阴性判读：只有内参质控点（GB）和表面化学修饰质控点（SP）同时显色则结果可靠。博晖微流控法可以同时检测6个样本，从进样到结果分析完成需要耗时4.5 h左右。

 

表1 博晖微流控法膜条示意图

  

BC：空白质控点；NC：阴性质控点；GB：内参质控点，排除由于磁珠提取和PCR反应失败导致的假阴性实验结果；显色质控点（SP）：主要监控所采用的杂交体系是否有有效。

 

BC 11 GB-50 68 56 45 31 SP NC 42 GB-20 73 58 51 33 16 81 43 GB-2 82 59 52 35 18 SP 44 6 83 66 53 39 SP

 

表2 博晖微流控HPV全自动核酸检测法的敏感度、特异度（n=224）

  

aC：结果判定标准，以亚能和博晖检测结果一致的作为参考标准，当两者结果不一致，透景流式荧光杂交法检测不一致结果，以较匹配的结果作为参考标准；T：检测方法；bCI：置信区间。

 

方法 标本检测结果数量a性能测试（95%CI）（%）bC+/T+C+/T-C-/T+C-T-敏感性 特异性博晖 89 2 4 129 95.70（89.35-98.82） 98.47（94.59-99.81）亚能 93 6 0 125 100（96.11-100.00） 95.42（90.30-98.30）

3 讨论

1.2.4 批间精密度和灵敏度检测 用4个已知基因型标本由同一操作者在同一时间内用博晖微流控检测法重复检测3次，得到12个结果用于验证博晖微流控检测法的批间精密度。把6个HPV基因型别（HPV6, 16, 18, 31, 42, 52）的质粒（1.0E7, copies/mL）依次稀释100倍、1,000倍、10,000倍、100,000倍，由博晖微流控法检测其结果，能检测到最小浓度即为其最低检测线。

Michael Mauer:优秀的设计源自于“天马行空”一般的创意，但它们最终要回归到源于纪律、架构、目标等略显枯燥的细化阶段。在这个阶段，除了自由和创意，我们还需要勤奋、认真和严谨的工作态度。就像我刚才说的，设计师可以用感性的方式来创新，但也必须要具备理性的思维来实践。好的设计师就像一名经验丰富的运动员，拥有十分准确的预判技巧，也有着沉着、冷静的执行能力。设计虽然能够令人沉醉其中，但我也不否认，做一名优秀的设计师其实很辛苦。

在此类电网企业数据中心中统计PUE，大多会碰到以上的问题。但提出PUE理论的绿色网格组织也并未给出标准的计算方法。在这种情况下，如果采取国内一般的测量计算方法则会产生较大的误差，所得出的数值不但没有很好的参考意义，也难以与其他数据中心进行比较分析。因此，必须研究一种方法更准确地统计此类电网企业数据中心的PUE值。

博晖微流控法可以同时检测6例标本，不需要人工预处理样本，从进样到得出结果，耗时约4.5 h，每一个芯片都是一个独立的实验室避免了交叉污染和受限于实验室环境条件。而膜杂交法可以同时检测96个样本，但需要人工操作，步骤繁琐，耗时长，而且易于交叉污染。

在双层模型中，系统调度是上层决策者，其目标是平滑有功负荷曲线。上层模型的目标函数见式(8)，由两部分组成：

持续的高危型HPV感染，特别是HPV16和HPV18的持续感染是大多数宫颈癌致病因素之一。HPV流行的地域和型别差异会影响疫苗的预防[5]，因此急需能够检测HPV相关型别分子生物学标志的监测方法。再者，由于持续的HPV感染需要数年才能进展为癌症，而临床缺乏对未引起细胞病变的HPV持续感染有效的治疗手段，因此良好的检测方法可以有效、及早的检测和识别HPV基因及其型别，可以使患者得到较好的预期结果。

大型系统或者管径在DN150及DN150以上时，排气装置宜采用集气罐与自动排气阀结合的形式，以利于更好地收集管路中的气体并及时排出。也可以使用大排气量的自动排气阀来实现这一功能。大排气量自动排气阀的材质应为黄铜，排气控制零件一般为浮球。

博晖微流控法无需人工进行样本的前处理，只需把样本放入芯片控制仪标本区即可，每一个芯片都是一个独立的分子生物实验室，可以自动完成细胞裂解、DNA扩增、杂交以及膜杂交，然后由计算机读取结果。博晖微流控法有着简单易操作、结果稳定、敏感性和特异性好、无交叉污染、对实验室环境要求低等优越性能，特别适合各种级别实验室使用。

参考文献

[1]文书, 陈漠月, 林璋礼, 等. TCT筛查和HC2-HPVDNA检测在宫颈癌前病变诊治中的临床应用[J]. 现代中西医结合杂志, 2013, 22(19): 2143-2144.

[2]王勇, 张蔚, 黄玥, 等. 人乳头状瘤病毒DNA联合薄层液基细胞学检查在宫颈癌及早期宫颈病变筛查中的价值[J]. 中华实用诊断与治疗杂志, 2015, 29(11): 1125-1127.

[3]王方. 高危型人乳头瘤病毒检测联合液基薄层细胞学检查在宫颈癌筛查中的临床价值[J]. 临床和实验医学杂志, 2010,9(6): 443-444.

[4]Zhou P, Young L, Chen Z. Weak solvent based chip lamination and characterization of on-chip valve and pump [J]. Biomed Microdevices, 2010, 12(5): 821-832.

[5]Kahn JA, Brown DR, Ding L,et al. Vaccine-type human papillomavirus and evidence of herd protection after vaccine introduction [J]. Pediatrics, 2012, 130(2):e249-e256.