5-Aza-CdR对人肺腺癌A549细胞及SHOX2基因甲基化的影响

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，起病隐匿，发现时多处于中晚期，延误了治疗，严重危害了人们的身体健康[1]。肺癌发生原因复杂，遗传基因缺陷和表观遗传改变是其影响因素之一。表观遗传是指通过改变自身的修饰方式影响基因的表达，而DNA序列不发生改变。DNA甲基化是最常见的修饰方式之一。通过甲基化或去甲基化导致一些癌基因激活和(或)抑癌基因沉默[2-3]。DNA甲基化常常发生在细胞癌变早期，可作为早期分子诊断标志物[4]，是近年来肿瘤研究的热点之一。矮小同源盒基因2(short stat ure homeobox 2，SHOX2)是一个与器官发育密切相关的基因[5]，近年研究发现SHOX2甲基化与肺癌高度相关，是肺癌重要标记分子之一[6-7]。DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR能够降低甲基转移酶的表达，使异常甲基化的生长调控基因恢复其转录活性，逆转肿瘤的恶性表型。本研究通过5-Aza-CdR处理人肺腺癌细胞系A549，观察其细胞生物学行为和SHOX2甲基化的改变，探讨该基因在肺癌治疗中的潜在价值。

1 材料和方法

1.1 材料

人肺腺癌细胞株A549由本中心保存。RPMI 1640培养液(Hyclone公司)，胎牛血清(四季青公司)，5-氮杂-2’-脱氧胞苷酸(5-Aza-CdR，Sigma公司)，DNA提取试剂盒、DNA重亚硫酸盐转化试剂盒和甲基化特异性PCR试剂盒(北京天根公司)，细胞周期、凋亡检测试剂盒(碧云天公司)。

1.2 细胞培养和药物处理

人肺腺癌细胞株A549培养于RPMI-1640培养基(含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)，于37 ℃、5%CO2恒温闭式培养箱内培养和传代。5-Aza-CdR用灭菌PBS配成l mmol/L的储存液，以培养基稀释成终浓度为l、5、10 μmol/L工作液。

1.3 MTT检测5-Aza-CdR 对A549细胞增殖的影响

取对数生长期A549细胞，常规消化后按每孔5×103个(200 μL)接种于96孔培养板，每组4个复孔。培养24 h后去上清，每组分别加入含l、5、10 μmol/L 5-Aza-CdR的完全培养基继续培养(实验组)，同时做对照组(药物浓度为0)，于24、48、72 h后加入5 g/L MTT溶液20 μL，继续孵育4 h，加DMSO150 μL，振荡10 min充分溶解结晶，测A490值。计算细胞增殖抑制率=(对照组A490-实验组A490)/对照组A490×100%。实验重复3次。

1.4 流式细胞仪检测5-Aza-CdR对A549细胞周期的影响

将l、5、10 μmol/L 5-Aza-CdR作用A549细胞72 h，胰酶消化并收集细胞，PBS洗2遍后调整细胞密度为1×106个/mL。70%冰乙醇固定2 h以上，PBS冲洗后加入终质量浓度为200 mg/L RNase A和终质量浓度为50 mg/L碘化丙啶(PI)，37 ℃避光30 min后，1 h内上机检测。

1.5 流式细胞仪检测5-Aza-CdR对A549细胞凋亡的影响

Bering等人(2005)的研究发现，儿童更倾向认为个体死亡后其认知、愿望、情绪功能仍存在，而认为死亡后生物、精神生物、知觉功能会停止。我们的结果重复了儿童来生信念理解的这一特点。

1.6 MSP检测5-Aza-CdR对SHOX2基因甲基化状态

(3) 试验初期，排水管壁面积的大小会影响土体梯度比Gr值下降速度。与小直径排水管壁试样相比，在大直径试样条件下，砾质黏性土下降速度变缓的时间比小直径试样早3 h，砂质黏性土早3 h，粉质黏性土早1 h。梯度比下降速度大小为：大直径排水管壁试样>小直径排水管壁试样。

1.7 统计学处理

5-Aza-CdR作用A549细胞72 h后，流式细胞仪分析结果显示1、5、l0 μmol/L 5-Aza-CdR组凋亡率分别为(15.31±1.54)%、(26.53±1.87)%和(38.84±3.10)%，与对照组(11.35±0.37)%相比，5、l0 μmol/L组差异有统计学意义(P＜0.05或0.01)，如图3所示。

将l、5、10 μmol/L5-Aza-CdR作用A549细胞72 h，胰酶消化后收集细胞，用PBS洗2遍后，调整细胞密度为1×106个/mL。取100 μL细胞悬液，加入5 μL Annexin V和5 μL PI，室温孵育15 min后，加入400 μL binding buffer，1 h内上机检测。计算凋亡细胞占总细胞的百分比。

2 结果

2.1 5-Aza-CdR对A549细胞增殖的影响

（1）林业技术推广符合我国林业建设的科学发展观。随着我国林业建设进程的加快，林业建设已经从过去的单纯植树造林防护森林变为现在的以生态平衡和生态环境安全为主要出发点，同时兼顾到经济生产效益的可持续性生态林业建设。想要实现经济和环境生态两者之间的协调发展，一定要依靠现在发展起来的科技手段和技术，所以，林业技术推广就是新型林业技术和农户之间的一座无形的桥梁，为新时期的生态林业建设提供支撑。

分别用l、5、10 μmol/L 5-Aza-CdR作用A549细胞72 h，用DNA提取试剂盒提取各组DNA。取2 μg各组DNA进行亚硫酸氢盐修饰纯化(参照DNA重亚硫酸盐转化试剂盒方法)。参照文献[8]设计合成甲基化和非甲基化引物。甲基化上游引物为：5’-GATGT TTTTTTGTCGGAGC-3’，甲基化下游引物为：5'-AAAACTT CAAACGCAACGT-3’；非甲基化上游引物为 ：5’-ATTGATGTTTTTTTGTTG GAGT-3’，非甲基化下游引x物为：5’-AATAAAACTTCAAACACA ACAT-3’。 MSP扩增条件：95 ℃，预变性5 min；95℃变性30 s，58 ℃/53 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR结束后取5 μL 产物于2%的琼脂糖凝胶中，100 V电泳40 min，于凝胶成像系统中成像并摄像。

苏鹏飞等[6]通过雾化法制备René104 镍基高温合金粉末，制备样品具有良好的球形度和适宜的含氧量。

 

表1 5-Aza-CdR对A549细胞增殖的影响 (±s，n=3)

  

相同时间内，与对照组比较：aP＜0.05，b P＜0.01；与1 μmol/L比较：cP＜0.05，d P＜0.01；与5 μmol/L比较：e P＜0.05，fP＜0.01

 

分组 A490抑制率/%24 h48 h72 h24 h 48 h 72 h对照组0.415±0.0310.696±0.0970.828±0.081－ － －1 μmol/L0.404±0.0510.565±0.028a0.621±0.031b2.6518.8225.02 5 μmol/L0.306±0.019ac0.431±0.052bc0.486±0.013bd26.2938.0741.30 10 μmol/L0.167±0.037bdf0.246±0.011bde0.279±0.021bdf59.7664.6566.30

2.2 5-Aza-CdR对A549细胞周期的影响

MSP检测显示SHOX2基因启动子在肺癌A549细胞中呈高甲基化状态(对照组)；细胞经5-Aza-CdR作用后，1、5 μmol/L组呈部分甲基化状态；10 μmol/L组未检测到甲基化状态；阴性对照组(水)未检测到甲基化和非甲基化状态。图4可见，5-Aza-CdR 能通过去甲基化作用逆转SHOX2基因启动子的高甲基化状态。

  

图2 5-Aza-CdR对A549细胞周期的影响

 

表2 5-Aza-CdR对A549细胞周期的影响 (±s ，n=3)

  

与对照组比较：aP＜0.01

 

组别G1S G2对照组61.15±1.2311.26±0.0818.52±2.35 1 μmol/L60.10±1.5814.20±0.0717.13±1.82 5 μmol/L58.24±1.2619.15±0.10a14.16±0.08 10 μmol/L53.62±1.34a23.25±0.09a17.82±2.06

2.3 5-Aza-CdR对A549细胞凋亡的影响

将所得实验数据经SPSS 18.0统计学软件分析，计量资料以 ±s表示，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析及q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.4 5-Aza-CdR对A549细胞SHOX2甲基化状态的影响

5-Aza-CdR处理A549细胞72 h后，流式细胞仪检测分析，随着 5-Aza-CdR浓度的增加S期细胞增多，而G1期细胞减少，如图2。5、10 μmol/L 组S期细胞与对照组相比明显增多(P＜0.05)，而G1期细胞与对照组相比明显减少(P＜0.05)。详见表2。

MTT检测结果显示，5-Aza-CdR呈浓度依赖性抑制A549细胞增殖(P＜0.05或0.01)，详见表1。

  

图3 不同浓度5-Aza-CdR作用A549细胞72 h后细胞凋亡率的变化

 

与对照组相比：aP＜0.05，bP＜0.01

  

图4 5-Aza-CdR对A549细胞SHOX2甲基化状态的影响

 

M：甲基化；U：非甲基化

3 讨论

SHOX2位于人类3号染色体长臂(3q25-q26.1)，与人类矮小同源盒基因SHOX高度同源[9]。SHOX2基因在胚胎时期表达于中胚层和外胚层，对骨骼、心脏和神经系统的发育起到重要的作用。基因内部包含10个CpG岛，而CpG岛上甲基化与去甲基化调控着基因的表达[10]。2010年Schmidt 等[11]首次发现，SHOX2 甲基化能较好区分肺部良恶性病变，灵敏度和特异度分别为68%和 95%。目前，SHOX2基因在肺癌中得到了广泛的研究，研究者已在肺癌患者支气管灌洗抽吸物[12]、外周血浆[13]、淋巴结[14]等组织中检测到SHOX2基因的高度甲基化，其频率、特异性、敏感性均较高。SHOX2 甲基化状态与肺癌的发生、发展密切相关。

5-Aza-CdR是一种脱氧胞苷类似物，磷酸化后能与DNA甲基转移酶1(DNMTl)结合形成共价复合物，抑制其与DNA结合发挥该酶的甲基转移活性，从而实现去甲基化功能[15]。实验通过MSP方法检测了5-Aza-CdR对SHOX2甲基化状态的影响，结果显示随着5-Aza-CdR浓度的增加，SHOX2基因启动子的甲基化条带减弱，非甲基化条带增强，可见在A549细胞中，SHOX2基因的表达受启动子CpG岛甲基化程度的调控，5-Aza-CdR去甲基化可以逆转SHOX2基因的甲基化状态，恢复其表达。

本研究参照文献[16-17]选用1、5、10 μmol/L 5-Aza-CdR处理A549细胞，结果显示其增殖能力有不同程度的减弱。细胞周期实验表明随着 5-Aza-CdR浓度的增加S期细胞增多，而G1期细胞减少。Annexin V/ PI细胞凋亡实验表明，5-Aza-CdR还可呈浓度依赖性促进细胞的凋亡。结合5-Aza-CdR去甲基化作用，说明该药主要通过逆转异常基因的甲基化直接或间接导致抑癌基因重新表达而发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。

3.招投标行为不严谨。没有按有关规定对分包队伍进行招标。普遍存在着由于甲方指定、处理工农关系等各种原因而引进施工队伍，其中就包括一些无资质的队伍，甚至有的还与个人签订所谓的分包合同，非法转包，甚至一包再包的现象也时有发生。

综上，SHOX2基因的甲基化是肺癌发生、发展的重要促进因素之一，对早期诊断有重要意义；去甲基化药物5-Aza-CdR可以逆转SHOX2基因的甲基化状态，有可能成为抗肿瘤药物。

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