华蟾素对胃癌肿瘤细胞SGC-7901增殖、凋亡以及JAK/STAT3信号通路的影响

胃癌患者5年生存率一般在30%左右，约90%需接受化疗[1]，而化疗毒副反应大。因此，进一步探索胃癌的发病机制，寻找低毒有效的抗肿瘤药物是当今临床与基础研究的热点。本研究选用胃癌细胞株SGC-7901为研究对象，加以华蟾素干预，采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)比色法、逆转录PCR(RTPCR)等实验方法体外研究华蟾素对胃癌肿瘤细胞增殖、凋亡及Janus蛋白酪氨酸激酶/转录激活因子3(JAK/STAT3) 信号通路的影响，旨为临床华蟾素治疗胃癌提供理论和实验依据。

由图5可知，掺加粉煤灰对混凝土在28 d时的水、气体渗透系数的影响大体规律是一致的。掺量在30 %以内，随着粉煤灰的掺量增加，混凝土水和气体渗透系数均随粉煤灰掺量的增加有较明显的降低，表明粉煤灰能有效地降低混凝土的水与气体渗透性。而粉煤灰掺量超过了30 %后，则混凝土的水与气体渗透性有所增加。因此，大掺量粉煤灰不利于降低混凝土的水和气体渗透性[4,9]。但总体上，掺加粉煤灰之后，混凝土的水和气体渗透性均低于对比组1的，其中，降低混凝土气体渗透性的最佳掺量是30 %，而降低混凝土水渗透性的最佳掺量是40 %。

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌细胞株SGC-7901购自中科院上海细胞库；Cino购自安徽金蟾生化股份有限公司；5-FU购自北京华迈科生物技术有限公司；DMEM、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝均购自Sigma公司；RT-PCR试剂盒购自Promega公司；p-STAT3检测试剂购自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人胃癌细胞SGC-7901置于以DMEM培养液(含10%FBS、100 U/mL青霉素和 100 mg/L链霉素)制成细胞悬液，于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。取对数生长期细胞，以0.25%胰蛋白酶消化，离心弃上清液，调整细胞密度为1×105个/mL备用。

1.2.2 实验分组 对照组(加用等体积的磷酸盐缓冲液PBS液)，5-FU组单用5-FU(20 mg/L)，不同浓度华蟾素组(Cino 1 组，0.1 mg/L，Cino 2 组，1 mg /L，Cino 3 组，10 mg/L)共 5 组。

1.2.4 RT-PCR法检测细胞周期调控因子(Cyclin D1、PCNA)及凋亡抑制基因Bcl-2 的mRNA表达水平 对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901胰酶消化后，取2×105个细胞/孔，接种于 6 孔培养板中，培养 24 h后，再用质量浓度不同的华蟾素及 5-FU给药干预，继续培养24 h后收集细胞，用Trizol法提取总RNA，逆转录为cDNA，PCR扩增，β-actin基因为内参，1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析仪对DNA条带进行扫描拍照，计算其平均光密度，目的基因的表达量用mRNA表达指数(RI)表示，RI=目的基因扩增产物平均光密度/β-actin扩增产物平均光密度)，进行半定量分析，以判断目的基因的相对表达量，各目的片段扩增引物序列及大小见表1。

1.2.3 MTT法检测胃癌肿瘤细胞增殖活力 将备用的细胞悬液接种于 96 孔培养板中，每孔100 μL，每组6个复孔。常规培养 24 h后，加入5-FU和不同质量浓度华蟾素，对照组(直接加等体积的PBS)。每组均取3个不同时点(12、24、48h)检测细胞增殖活力，培养12、24、48 h后，每孔加入 5 g/L的MTT溶液10 μL，继续培养 4 h，然后吸弃各孔中的液体，加入DMSO 100 μL /孔，振荡混匀，室温放置 10 min，使结晶充分溶解并混匀，于全自动酶标仪 570 nm测定各组吸光度值(即A值)，并按下列公式计算细胞活力：细胞抑制率(%)=(1－实验组A值/对照组A值)×100%。

第1天，将召开一个首次会议，受检方的主要人员参加。主检查员会给受检方一封认证通知函，告之检查的依据和检查员名单。之后，会要求受检方出具一个书面函件，确认本次认证的范围。同时，检查员出具另一个通知，要求受检方准备好所列目录中的资料，以便开展检查。

 

表1 扩增目的片段的引物序列及大小

  

Cyclin D1上游：CTGGCCATGAACTACCTGGA下游：GTCACACTTGATCACTCTGG上游：GCTGACATGGGACACTTA下游：CTCAGGTACAAACTTGGT上游：CAGCTGCACCTGACGCCCTT下游：GCCTCCGTTATCCTGGATCC上游：ACCACAGTCCATGCCATCAC下游：TCCACCACCCTGTTGCTGTAl PCNA Bcl-2 β-actin 483 610 362 450

用“转化器”来形容艺术家最合适不过，艺术家的转化能力或许决定了作品艺术的味道。对于创作女性主题绘画的人来说，无论使用何种笔触，都可转化为“色彩”，而不是停留在瓷画材料特性（颜料）层面。不仅如此，还要让色彩成调性配伍，无论粗细线条，都赋予其个性特色的“书写性”。创作女性绘画题材的纯粹，大概就是在这样敏感鲜活的心手之间源源跃出，而不单是为了形式，更不是为出奇。

1.2.5 蛋白悬液芯片(Bio-plex)法检测胃癌肿瘤细胞STAT3 磷酸化水平 对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901 胰酶消化处理后，以DMEM培养液制成细胞悬液，调整细胞密度为 1×105个/mL，接种于25 cm2的培养瓶中，常规培养 24 h后，分别加入 5-FU和不同质量浓度华蟾素干预，继续培养 24 h，去除培养液，收集细胞，提取总蛋白。在抽滤板中加入 50 μL藕连好的微球，洗板，加入 25 μL蛋白样品，孵育过夜，洗板 3 次，加入检测抗体 25 μL，孵育 30 min，洗板 3 次，最后加入 125 μL的重悬缓冲液，上机检测，设置管家基因Housekeeping磷酸化蛋白为内参。

随着华蟾素质量浓度的增大，同一时间不同质量浓度组SGC-7901细胞增殖抑制率逐渐上升，呈质量浓度依赖性，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；质量浓度为10 mg/L的华蟾素组对肿瘤细胞抑制作用高于5-FU组(P＜0.05)，统计学处理结果显示：12 h 各质量浓度组间，F=16.184，P=0.055；24 h 各质量浓度组间，F= 35.145，P=0.031；48 h 各质量浓度组间，F=80.651，P=0.021。随着华蟾素作用时间的延长，同组不同时间点SGC-7901细胞增殖抑制率逐渐增加，呈时间依赖性，统计学处理结果显示：Cino 1组间，F=9.578，P=0.032；Cino 2组间，F=20.341，P=0.024； Cino 3组 间 ，F=57.741，P=0.018。详见图 1、表2。

1.3 统计学处理

以β-action为内参照基因，不同处理组作用于SGC-7901 细胞后，细胞周期调控因子(Cyclin D1、PCNA)及凋亡抑制基因Bcl-2的mRNA表达水平随华蟾素质量浓度增加，表达水平降低(均P＜0.05)，呈质量浓度依赖性，详见图2、表3。

2 结果

2.1 不同质量浓度华蟾素及 5-FU对SGC-7901 细胞增殖活力的影响

1)学生计算机理论知识掌握较之前有显著好转。在此教学模式下，学生可以通过课前导学和课后总结梳理自己的理论知识，并将理论应用到实际任务中去，真正做到理论和实践相统一。2)做到了真正的分层次教学。采用线上线下混合式教学，我们可以把学习资料和任务要求，分难度等级发布到网上，学生可以根据自身的情况有选择性有针对性的学习和操作，从而满足了不同学生的学习需求。3)师生随时互动，过程化考核成为可能。老师可以通过查阅学生作业，统计学生观看教学视频的次数和回复的周记,了解每个学生的学习进度和难点困惑，并能通过掌上app随时解答学生问题，对学生有了更多的互动考察机会。

  

图1 不同质量浓度华蟾素及5-FU在不同时间对SGC-7901细胞的抑制作用

 

表2 各组药物不同时点对SGC-7901细胞增殖抑制率的比较 (n=6，±s，%)

  

与对照组比较：aP＜0.05；与5-FU组比较：bP＜0.05

 

作用时间浓度(mg/L)12 h24 h48 h 1%0.000.000.00 20.015.30±0.56a25.78±1.44a34.24±1.37a0.112.27±0.82a15.96±0.74a20.75±1.25a组别对照组5-FU组Cino 1组Cino 2组Cino 3组质量1.0 10.0 21.75±0.62a35.25±0.85a43.94±0.78a24.27±1.45ab56.45±1.75ab68.28±1.91ab

2.2 不同质量浓度华蟾素及 5-FU对细胞周期调控因子(Cyclin D1、PCNA)及凋亡抑制基因Bcl-2的mRNA 表达水平的影响

采用SPSS 21.0软件作统计学处理，所有数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析及 q 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.3 不同质量浓度华蟾素及5-FU对SGC-7901细胞STAT3磷酸化水平的影响

Bio-plex检测显示：不同质量浓度华蟾素及5-FU均有抑制SGC-7901细胞p-STAT3蛋白表达与对照组的差异有统计学意义(P＜0.05)，且随着华蟾素质量浓度增加，p-STAT3蛋白表达水平逐渐降低，抑制作用增强，呈剂量依赖性(F=36.157，P＜0.05)。质量浓度为10 mg/L的华蟾素组较5-FU组抑制作用明显(P＜0.05)，见图3。

  

图2 不同质量浓度华蟾素及5-FU对Cyclin D1、PCNA、Bcl-2的mRNA表达水平影响

 

表3 细胞周期调控因子(CyclinD1、PCNA)及凋亡抑制基因Bcl-2的mRNA表达的影响 (n=6，RI，±s)

  

与对照组比较：aP＜0.05；与5-FU组比较：bP＜0.05

 

组别对照组5-FU组Cino 1组Cino 2组Cino 3组P值质量浓度(mg/L)1%20.0 0.1 1.0 10.0 Cyclin D1 0.95±0.05 PCNA 0.76±0.01 Bcl-2 0.92±0.04 0.41±0.03a0.31±0.02a0.30±0.02a0.67±0.03a0.53±0.03a0.60±0.01a0.49±0.02a0.33±0.01a0.36±0.02a0.22±0.03 0.015ab0.18±0.02 0.028ab0.14±0.03 0.036 ab

  

图3 不同质量浓度华蟾素及5-FU对SGC-7901细胞STAT3 磷酸化水平表达的影响

 

注*为与对照组比较，P＜0.05；△为与5-FU组比较P＜0.05

3 讨论

肿瘤的发生、发展不仅与细胞的增殖和分化异常有关，而且与细胞凋亡异常密切相关[2-3]，JAK/STAT3 信号通路是近年发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程[4-5]。STAT3是该信号通路中一个至关重要的转录因子，在细胞内起着重要的信号传递作用，p-STAT3是其磷酸化的活性形式，活化的STAT3进入细胞核内，特异性结合DNA，调节其下游的靶基因转录。导致特异性周期蛋白-D1(Cyclin D1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、凋亡抑制基因Bcl-2等异常激活，加速细胞周期循环、诱导细胞转化和抑制细胞凋亡等功能[6]。研究表明：在正常生理状态下，STAT3的激活是短暂而且受严格调控的，然而JAK/STAT3信号通路持续、异常激活会造成肿瘤细胞的过度增殖、抑制凋亡从而导致肿瘤的发生。因此，阻断肿瘤细胞中JAK/STAT3信号通路传导可起到治疗肿瘤的目的[7-8]。

传统化疗药物毒副反应大，对正常组织细胞、器官功能产生一定的损害作用，并抑制机体免疫功能和骨髓造血功能。因此寻找低毒有效的抗肿瘤药物意义重大。大量临床实践表明，中药具有毒副作用小，而且与化疗联合治疗肿瘤，可以减轻化疗的毒副反应，并达到协同增效的结果。

华蟾素是中华大蟾蜍皮经加工提炼制成，其主要活性成分为吲哚生物碱、蟾蜍毒素、蟾蜍色胺等，具有抗肿瘤、抗病毒，调节机体免疫功能。临床应用于多种中晚期肿瘤治疗，但其具体抗肿瘤机制尚不太清楚。从本组实验结果来看，Cino与5-FU对胃癌肿瘤细胞均有抑制作用，在一定范围内，随Cino质量浓度增加及作用时间的延长，抑制率增加，呈剂量和时间依赖性(P＜0.05)；质量浓度为10 mg/L的华蟾素组对肿瘤细胞抑制作用高于5-FU组(P＜0.05)，说明10 mg/L的华蟾素体外单独应用能达到比5-FU更好的抗肿瘤效果。RT-PCR分析显示：Cino可以明显抑制Cyclin D1、PCNA、Bcl-2的mRNA表达水平，随Cino浓度增加，表达水平降低(均P＜0.05)，呈浓度依赖性，这表明Cino抑制胃癌肿瘤细胞的增殖可能与其下调Cyclin D1、PCNA及Bcl-2 基因表达有关。同时进一步Bio-plex分析显示：华蟾素及5-FU均有下调SGC-7901细胞STAT3 磷酸化水平，随着华蟾素质量浓度增加，抑制作用增加，呈剂量依赖性(F= 36.157，P＜0.05)。正因为STAT3是细胞生长、增殖、凋亡过程中一个至关重要的转录因子，其活性形式p-STAT3在细胞内起着重要的信号传递作用，这表明Cino是通过抑制STAT3活化，继而抑制其下游靶基因的表达，达到抑制胃癌肿瘤细胞增殖和促进凋亡的作用。

参考文献：

[1]何裕隆.进展期胃癌的化疗[J].消化肿瘤杂志(电子版),2010,2(3):132-136.

[2]Steeg P S,Bevilacqua G,Kopper L,et al.Evidence for a novel gene assccialec with low lumor melaslalic pclenlial[J].Natl Cancer Inst,2013,80(3):200-204.

[3]Kodera Y,Isobe K,Yamauchi M,et al.Expression of nm23H-1RNA levels In human gastric cancer tissues[J].Cancer,1994,73(2):259-265.

[4]郭昱,霍瑞静,姚金峰.黄芩苷对肝癌细胞SMMC-7721 JAK-STAT信号通路STAT3的影响[J].世界华人杂志,2011,19(22):2363-2367.

[5]Luo Y,Wang Z,Su L,et al.Non-CSCs nourish CSCs through interleukin- 17E- mediated activation of NF-KB and JAK/STAT3 signaling in human hepatocellurar carcinoma[J].Cancer Lett,2016,375(2):390-399.

[6]李志铭,朱颖杰.JAK/STAT通路及其阻断剂AG490在淋巴瘤中的研究进展[J].中国肿瘤临床,2014,41(19):1221-1224.

[7]Wang H,Lafdic F,Kong X,et al.Signal transducer and activator of transcription 3 in liver diseases:a novel therapeutic target[J].Int J Biol Sci,2015(7):536-550.

[8]Zhang J,Gill A,Atmore B,et al.Upregulation of the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in lymphatic metastases of papillary thyroid cancer[J].Int J Clin Exp Pathol ,2015(4):356-362.