PM2.5对小鼠过敏性哮喘模型炎症反应的影响

PM2.5与呼吸系统疾病有密切联系，还会增加心血管疾病死亡率[1-4]。哮喘是一种常见的呼吸系统疾病，不同致病因素都可以引起生理性的气道功能障碍，但过敏反应是主要原因。当患者接触致敏原时，嗜酸性粒细胞(EOS)聚集到肺部，并释放出促炎性介质[5-6]，血清IgE水平升高[7]。已有文献报道，Th2细胞的免疫应答在过敏性哮喘炎症过程发挥关键作用[8]。Th2相关细胞因子和肿瘤坏死因子α(TNF-α)产生失调被认为是过敏性哮喘的潜在发病机制之一[9]。通过释放Th2细胞因子，Th2细胞应答并启动变应性反应，继而引起IgE水平升高，嗜酸性粒细胞向气道聚集[8]。Th1相关细胞因子会拮抗Th2细胞应答和IgE合成，可能会减缓哮喘发病过程[10]。哮喘患者痰液中抗炎细胞因子IL-10水平下降[11]。细颗粒物会增加气道炎症并转变免疫细胞表型，这在哮喘患者身上表现更为突出[12-14]。在本研究中，我们将进一步探索PM2.5在先天性和适应性免疫应答中的影响，进一步揭示PM2.5加重哮喘的机制。

由于仿真区间较短，所受限制较少，多列车节能优化仿真效果明显。时刻表优化前后，全线运行时间442 s维持不变，列车能耗下降约7.87%，线路损耗下降约29.21%，全线能耗下降约8.23%。优化后，由于线路中电流无较大范围内的波动，线路损耗下降较多，且列车能够有效地使用制动能量，从而降低全线损耗。

一般来说，如果水文序列出现了两个显著的阶段性过程，Sn（r）的时序变化出现单谷底；如果出现两个或以上的显著阶段性过程，则Sn（r）的时序变化出现两个或以上谷底，因此根据谷底发生的时间来划分水文序列变化的阶段是合理可信的。

1 材料和方法

1.1 PM2.5样品和特点

PM2.5来源于我们先前的实验[15]。在卵清蛋白(OVA)最后1次激发后用PM2.5处理小鼠。实验结束时，用全身体积描记法处理小鼠或将其处死，收集血清和肺泡灌洗液。收集小鼠的肺组织并保存在多聚甲醛中，用来进行后面的组织学实验。

1.2 试剂和抗体

DMEM培养基、青霉素、链霉素和胎牛血清购于GIBCO-BRL生命科技公司(美国)。胰蛋白酶-乙二胺四乙酸来自于Sigma公司(美国)。OVA购于Sigma Aldrich公司(美国)。

1.3 动物及其处理

用4%多聚甲醛固定肺组织，后用石蜡包埋、切片、脱色。用HE染色并分析各组小鼠肺组织病理变化。根据炎症细胞浸润程度分为4个等级：正常为0级；有少量细胞为1级；有4个炎症细胞环绕为2级；超过4个炎症细胞环绕为3级。从每个小鼠肺组织取20张切片，用图像分析软件(ANALYSIS FIVE)分析黏液和胶原蛋白沉积情况。

1.4 支气管肺泡灌洗液(BALF)收集和细胞因子测定

但毋庸置疑的是，我们都很陶醉于这样的体验。虽然漂移很过瘾，但在赛道上严肃驾驶时，R8 RWS在转向、制动等方面的表现并不如人意，不过能够安慰我的是，在舒适性和赛道表现这两个彼此矛盾的话题上，奥迪R8 RWS在舒适和性能之间的平衡让它更具魅力。可以说，在实用性和性能之间，奥迪做出了妥协，但毕竟生活不仅只有赛道。

1.5 气道高反应性(AHR)评估

在最后1次激发24 h后用侵入性强迫震荡技术(SCIREQ动物肺功能检测仪，加拿大)评估气道对乙酰甲胆碱的高反应[16]。给小鼠吸入浓度逐渐递增的雾化乙酰甲胆碱(从0～0.2 mol/L)持续3 min。每2 min记录一次读数。用增强呼吸间歇(Penh)这种无创的方法来记录箱内小鼠呼气/吸气比例和呼气停止时间。

1.6 肺部炎症的组织病理学分析

严格按照《广东医科大学实验动物管理规定》进行，动物实验得到广东医科大学实验动物伦理委员会批准[许可证号：SCXK(广东)2013-0008]。本实验尽可能减少实验动物数量并减轻对它们的伤害。6～8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠购自广东医学实验动物中心。小鼠随机分成空白对照组、OVA组、OVA+PM2.5组，每组9只。将10 g OVA和1 g氢氧化铝溶解在100 mL双蒸水中调成10%致敏液。空白对照组以生理盐水处理，OVA组、OVA+PM2.5组按照50 mL/kg体质量分别于第1、8、15天腹腔内注射致敏液。第16天开始，OVA组、OVA+PM2.5组每天用1% OVA致敏液雾化吸入，每次40 min，持续1周，建立过敏性哮喘模型；对照组用生理盐水处理。OVA+PM2.5组在第1次激发后同1天按15 μg/kg体质量气管内滴注PM2.5。在第8天检测血清嗜酸性粒细胞和白细胞总数来评估致敏效果。分别在第17、20、23天处死小鼠，每次随机处死3只，收集肺泡灌洗液进行白细胞分类计数；取出肺组织将其冰冻并切片以进行免疫荧光染色和病理分析。

1.7 统计学处理

“什么！没有？”杨秋香立即发了火，她眼睛瞪得如鸡蛋大，唾沫星子都喷到了杨力生脸上，“你再说一句‘没有’试试？”杨力生估量她是已经知道这回事了，想瞒也瞒不住，只好如实相告。杨秋香气得大口喘着气：“你说说，你说说，这个家是你一个人的家，还是两个人的家？”

2 结果

2.1 在OVA诱导的小鼠哮喘模型中PM2.5对炎症细胞个数和气道反应的影响

3组小鼠BALF中细胞总数和分类计数详见表1～4。OVA+PM2.5组的细胞总数和嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞的数量均明显高于空白对照组和OVA组(P＜0.01)。在OVA激发24h后，用不同浓度的乙酰甲胆碱通过全身体积描记法测量Penh，可以观察到，随着乙酰甲胆碱浓度逐渐升高，OVA+PM2.5组的支气管反应性显著高于空白对照组和OVA组(表5)。这些结果表明PM2.5除了对细胞炎症有作用，还促进了生理性气道改变。

用SPSS 17.0软件进行统计学处理。计量资料以±s表示，采用单因素方差分析及q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

首先用2%的戊巴比妥(Sigma-Aldrich公司，美国)腹腔内注射将小鼠麻醉，然后暴露气管并注入400 μL PBS，这个步骤共重复3次，记录灌洗液体积，将灌洗液离心浓缩并进行总活细胞计数，用Diff-Quick细胞计数器(Life Technologies，新西兰)对嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞分别计数。用ELISA试剂盒测定干扰素γ(IFNγ)和IL-4水平。

 

表1 肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞计数(±s ，n=9，×104)

  

与空白对照组比较：aP＜0.01；与OVA组比较：bP＜0.01

 

项目 空白对照组OVA组OVA+PM2.5组致敏1致敏2致敏3激发1激发4激发7 0.145±0.035 0.137±0.041 0.223±0.130 0.128±0.022 0.152±0.026 0.208±0.029 0.153±0.033 0.203±0.122 0.128±0.021 0.153±0.033 0.203±0.122 0.128±0.021 0.288±0.019a1.670±0.277ab7.283±1.106a15.550±1.776ab17.167±2.925a37.893±0.781ab

2.2 哮喘小鼠模型中炎症介质应对PM2.5暴露的反应

 

表2 肺泡灌洗液中中性粒细胞计数 (±s，n=9，×104)

  

与空白对照组比较：aP＜0.01；与OVA组比较：bP＜0.01

 

项目致敏1致敏2致敏3激发1激发4激发7空白对照组12.500±0.750 13.708±4.070 11.958±4.089 12.833±2.255 15.167±2.566 20.833±2.930 OVA组15.250±3.279 13.592±2.370 12.750±2.132 OVA+PM2.5组15.250±3.279 13.633±2.302 12.750±2.132 17.300±1.136a94.200±23.385ab116.533±17.697a255.467±30.404ab309.000±52.651a37.893±0.781b

 

表3 肺泡灌洗液中巨噬细胞计数 (±s，n=9，×104)

  

与空白对照组比较：aP＜0.01；与OVA组比较：bP＜0.01

 

项目 空白对照组OVA组OVA+PM2.5组致敏1致敏2致敏3激发1激发4激发7 0.870±0.213 0.823±0.244 1.338±0.779 0.770±0.135 0.910±0.154 1.350±0.030 0.915±0.197 1.218±0.731 0.765±0.128 1.153±0.076 0.915±0.197 1.218±0.731 0.765±0.128 6.280±1.559ab15.900±1.400a32.100±2.340ab15.400±0.885a32.787±0.853ab

 

表4 肺泡灌洗液中总细胞计数 (±s，n=9，×104)

  

与空白对照组比较：aP＜0.01；与OVA组比较：bP＜0.01

 

项目致敏1致敏2致敏3激发1激发4激发7空白对照组29.000±7.089 27.417±8.141 44.583±25.960 25.667±4.509 30.333±0.154 41.667±5.859 OVA组30.500±6.557 40.600±24.369 25.500±4.265 28.833±1.893 OVA+PM2.5组30.500±6.557 40.600±24.369 25.500±4.265 157.000±38.974ab145.667±22.121a307.000±36.346ab359.000±37.643a540.333±11.846ab

 

表5 不同浓度乙酰甲胆碱对增强呼吸间歇(Penh%)的影响 (±s，n=9)

  

与空白对照组比较：aP＜0.01，bP＜0.05；与OVA组比较：c P＜0.01，dP＜0.05

 

浓度 空白对照组OVA组OVA+PM2.5组0 mol/L1±01±01±0 0.0125 mol/L1.233±0.3211.133±0.1151.433±0.321 0.025 mol/L1.233±0.1001.500±0.100b2.167±0.379ac0.05 mol/L1.800±0.7212.700±0.436b3.600±0.608ad0.1 mol/L3.100±0.7946.400±0.794a8.767±0.666ac0.2 mol/L3.633±1.1858.667±1.04113.167±1.258

为了探究PM2.5对过敏性哮喘小鼠模型的影响及其作用机制，我们评估了PM2.5暴露和炎症因子的关系。我们观察到PM2.5加剧了哮喘小鼠气道炎症和病理生理学改变此外，PM2.5引起Th1细胞因子如IFN-γ的减少，同时引起Th2细胞因子如IL-4的增多。

 

表6 PM2.5暴露对IFN-γ(ng/L)水平的影响 (±s，n=9)

  

与空白对照组比较：aP＜0.01，b P＜0.05；与OVA组比较：cP＜0.01，dP＜0.05

 

项目致敏1致敏2致敏3激发1激发4激发7空白对照组126.750±25.128 49.750±4.113 130.000±8.593 141.000±9.967 191.000±8.794 202.250±11.836 OVA组OVA+PM2.5组168.000±34.458a176.250±23.613c146.500±44.439a160.750±27.461c212.500±23.274a235.000±24.833cd100.250±16.460a91.500±13.717c71.500±10.206a48.500±9.574ac31.500±2.082a34.500±9.738c

3 讨论

OVA组和OVA+PM2.5组在激发后小鼠气道中产生了大量的IL-4，而且OVA+PM2.5组IL-4增多更为明显(表7)。相反，OVA+PM2.5组较空白对照组和OVA组小鼠在激发后的IFN-γ水平显著下降(表6)。此外，将不同组的固定肺组织切片并用苏木精和伊红染色后，我们发现和空白对照组相比，OVA+PM2.5组的炎症细胞浸润和肺泡上皮细胞基底膜增厚明显(图1)。

已有研究在关注PM2.5对哮喘的严重程度的影响[17]。在我们的实验中所使用的PM2.5来自中国湛江，其具体成分我们先前的报道中有详细说明[15]。虽然我们的研究结果表明PM2.5短期暴露不会引起过敏性小鼠的哮喘反应，但长期接触PM2.5或接触来自不同地理来源的PM2.5是否会诱发小鼠哮喘仍待研究。当然，对人类哮喘的相关研究也十分重要。有报道指出PM2.5会增加人们尤其是儿童的哮喘发病率[18-20]。在我们的研究中，OVA+PM2.5组的炎症细胞浸润(图1)、BALF中炎症细胞数(例如白细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)(表1～4)和增强呼吸间歇值(表5)明显高于OVA组和空白对照组。我们的研究与一些关于大气细颗粒物加剧哮喘小鼠模型哮喘样肺炎的报道结果一致[21-22]。

 

表7 PM2.5暴露对IL-4(ng/L)水平的影响 (±s ，n=9)

  

与空白对照组比较：aP＜0.01；与OVA组比较：bP＜0.01

 

OVA组?项目 空白对照组OVA+PM2.5组

  

图1 OVA和PM2.5暴露24 h后肺组织切片(HE染色，×400)

许多研究表明PM2.5暴露加重炎症反应[23-26]，最近研究人员使用哮喘小鼠模型进行的研究已经证实PM2.5可以诱发气道炎症[24]。哮喘最常见的表现是急性和迟发性超敏反应引起的过敏性炎症[27]。最近，Shadie等[28]报道在过敏性哮喘小鼠模型的研究中，IL-33在环境颗粒物加重气道炎症过程中发挥作用。

我们的研究结果表明IFN-γ在致敏阶段增加，在激发阶段降低。PM2.5暴露组的BALF中的炎症因子IL-4比空白对照组明显增多。此外，PM2.5暴露影响生理机能。这些证明PM2.5能加剧气道炎症并加重哮喘生理病程。

本研究的主要结论是PM2.5会加重哮喘模型小鼠的炎症反应并促进了生理性气道改变。本文的研究支持PM2.5会加重过敏性哮喘病情。

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