糖尿病大鼠牙髓干细胞增殖及成牙/成骨分化能力研究

牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是最早被发现并分离培养的牙源性干细胞，具有较强的增殖能力及多向分化潜能，是牙再生及骨再生种子细胞[1]。大量的研究表明DPSCs的生物学性能，尤其是增殖潜能和成牙成骨向分化能力受体内外各种因素的调节[2-5]。目前糖尿病或高血糖是全球范围高发的疾病，可引起心脑血管病变、肾病甚至导致死亡等并发症。研究发现高糖会降低骨髓间充质干细胞及牙周膜干细胞增殖能力及成牙成骨分化能力的降低，这也是高血糖会导致骨系统疾病及牙周病的病理基础[6-8]。而糖尿病对DPSCs的成牙成骨向分化能力以及增殖能力是否具有一定的调控及影响作用，目前尚未有文献报道。因此本实验通过选取高血糖GK大鼠模型进行实验，分离并培养其DPSCs，与正常Wistar大鼠DPSCs进行增殖能力及成牙成骨向分化能力比较，探讨糖尿病对DPSCs生物学性能的影响。

风峪沟中传统村落分布众多，形成了具有地域性特色的农耕文明及建筑风格[16]，周家庄古村原始风貌保存完整，传统建筑以村中龙王庙为核心沿东西展开，周家粮铺院是其中最具代表性的一处（图19）。纵观风峪沟沿线的传统建筑，因村落中村民个人生活多靠自给自足，粮铺建筑本就稀少，使得这类建筑的选址显得极为重要。周家庄古村位于晋阳古城西侧风峪驿道上的重要位置，在村中建造一处粮铺，即可满足来往商队的食品需求，又可为风峪沟内原始居民提供生活方便。

1　材料与方法

1.1　实验动物

实验动物由南京医科大学动物实验中心提供，实验组为3月龄糖尿病模型GK雄性大鼠6只，体质量(180±10)g，对照组为3月龄正常Wistar雄性大鼠6只，体质量(200±12)g，正常饮食饮水，饲养温度25 ℃。测试两组大鼠早晨进食2 h后尾静脉血糖。

1.2　主要试剂

α-MEM培养基(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，青霉素/链霉素双抗(Gibco)，Ⅰ型胶原酶(Sigma)，分散酶(Sigma)，胰蛋白酶(Gibco)，RIPA蛋白裂解液(碧云天)，SDS-PAGE凝胶试剂盒(凯基生物)，蛋白Marker(Fermentas)，SuperSignal West Pico化学发光底物(Thermo)，TRIzol(Invitrogen)，Primescrript 逆转录试剂盒(TaKaRa)，SYBR® Premix Ex TaqTM定量PCR酶混合物试剂盒(TaKaRa)，兔抗鼠牙本质基质蛋白1(dental matrix protein 1，DMP1)抗体(Abcom)、兔抗鼠成骨细胞特异性转录因子Osterix(Osx)抗体(Abcom)、兔抗鼠骨钙素(osteocalcin，OCN)抗体(Abcom)，兔抗鼠ACTIN(Bioworld)，二抗为羊抗兔IgG(中杉金桥)。

1.3　实验方法

1.3.1　大鼠DPSCs分离培养　待两组大鼠血糖稳定持续1周以上，分离获得两组大鼠牙齿，用含有双抗的0.01 mol/L的PBS缓冲液浸洗牙齿3次；无菌条件下分离提取牙髓组织，剪碎；分别加入3 mg/mL Ⅰ型胶原酶和4 mg/mL分散酶各1 mL，充分吹匀后于37 ℃消化30 min，每隔10 min吹打20次；1 000 r/min离心5 min，收集细胞及消化松散的组织块；加入5 mL含双抗和10%胎牛血清的α-MEM培养基，吹打均匀后接种于25 cm2培养瓶内，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养；次日换液，以后每2 d换液1次；倒置相差显微镜下观察细胞生长状况；待细胞达80%～85%融合时，2.5 g/L胰蛋白酶消化后以1∶3的比例传代，取第2～3代细胞用于以下实验。

1.3.2　MTT生长曲线的测定　将两组大鼠DPSCs以2×103个/孔的密度接种于96孔板，每组6个复孔，24 h贴壁后换液，分别于0、1、3、5及7 d后，加入5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃、5% CO2孵育4 h，弃去培养液，加入150 μL二甲基亚砜，将培养板置于微孔板振荡器上振荡10 min，待紫色结晶体完全溶解后，酶标仪波长490 nm检测各孔光密度(optical density，OD)值。

选取2015年1月～2017年12月吉林市职业病防治院接收的突发性职业中毒患者86例作为研究对象，将其随机分为研究组与对照组，各43例。其中，研究组男25例，女18例，年龄25～59岁，平均年龄（45.2±4.7）岁，中毒类型：三氯乙烯19例，二甲基甲酰胺15例，二氯乙烷9例；对照组男26例，女17例，年龄24～58岁，平均年龄（45.5±4.3）岁，中毒类型：三氯乙烯21例，二甲基甲酰胺14例，二氯乙烷8例。两组患者的性别、年龄及中毒类型等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.3.3　实时定量RT-PCR　培养7 d后分别收集GK-DPSCs及Wistar-DPSCs，各加入1 mL TRIzol，根据试剂供应商的说明提取细胞RNA，检测RNA的浓度，利用Primescrript逆转录试剂盒，根据说明书推荐的条件将1 μg RNA逆转录为cDNA，利用SYBR® Premix Ex TaqTM定量PCR酶混合物试剂盒和ABI 7300 Real-time RT-PCR仪器进行实时定量RT-PCR检测DMP1、Osx、OCN的基因表达，GAPDH为内参，所用引物如表1所示。反应体系：SYBR® Premix Ex TaqTM定量PCR酶25 μL，PCR正向引物及反向引物各2 μL，ROX参比染料1 μL，cDNA 4 μL，灭菌蒸馏水16 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。利用2-△△CT方法计算各指标的相对量，此试验重复进行3次。

 

表1　实时定量RT-PCR引物序列Tab.1　The primers of real-time RT-PCR

  

基因名称引物序列(5'→3')OCNF:AGCAAAGGTGCAGCCTTTGTR:GCGCCTGGGTCTCTTCACTOsxF:CCTCCTCAGCTCACCTTCTCR:GTTGGGAGCCCAAATAGAAADMP1F:CCCTTGGAGAGCAGTGAGTCR:CTCCTTTTCCTGTGCTCCTGGAPDHF:GAAGGTGAAGGTCGGAGTCR:GAGATGGTGATGGGATTTC

[7]　Kato H, Taguchi Y, Tominaga K, et al. High Glucose Concentrations Suppress the Proliferation of Human Periodontal Ligament Stem Cells and Their Differentiation Into Osteoblasts[J/OL]. J Periodontol，2016，87(4)：e44-e51[2017-11-16]. http://dx.doi.org/10.1902/jop.2015.150474.

1.4　统计学分析

两组数据比较采用t检验，P<0.05为统计学有差异。实时定量RT-PCR利用2-△△Ct方法，数据用均值±标准差表示，试验重复3次。

2　结　果

2.1　大鼠血糖检测结果

GK大鼠饲养1周后血糖稳定在20.1～22.3 mmol/L，对照组Wistar大鼠血糖值稳定在5.8～6.3 mmol/L(图1)。

  

图1　大鼠血糖浓度测定Fig.1　The concentration of glucose in blood

2.2　DPSCs增殖能力检测结果

综上，本研究发现糖尿病状态会降低DPSCs增殖能力及成牙成骨向分化能力，为组织工程牙、骨再生选择合适的种子细胞提供依据及临床上遇到糖尿病病人牙髓保存治疗提供一定的参考，而糖尿病状态下降低DPSCs增殖能力及成牙成骨向分化能力的通路机制还需进一步的研究。

 

*、**：与对照组比较，P<0.05、P<0.01

图2　MTT测定生长曲线

Fig.2　The growth curve of DPSCs by MTT assay

2.3　实时定量RT-PCR检测结果

[5]　Al-Habib M, Yu Z, Huang GT. Small molecules affect human dental pulp stem cell properties via multiple signaling pathways[J/OL]. Stem Cells Dev，2013，22(17)：2402-2413[2017-11-16]. http://dx.doi.org/10.1089/scd.2012.0426.

2.4　Western blot检测结果

Western blot检测结果显示GK-DPSCs组OCN、OSX及DMP1蛋白量表达明显较对照组降低(图4)，进一步显示糖尿病状态下DPSCs成牙成骨分化能力会降低。

 

*：1<2-ΔΔCt <2，P<0.01；**：2-ΔΔCt≥2，P<0.01

图3　实时定量RT-PCR检测基因表达

Fig.3　The expression of genes by real-time RT-PCR

  

图4　Western blot检测结果Fig.4　The expression of proteins by Western blot

3　讨　论

牙髓组织在牙髓疾病发展的过程中具有修复及防御的作用，因此恒牙在治疗中保存全部牙髓或者部分牙髓具有重要意义，而直接盖髓术及活髓切断术也不仅仅在年轻恒牙治疗中运用，目前越来越多的学者对根尖孔发育成熟的恒牙也进行生物活性陶瓷直接盖髓或者活髓切断术以保留牙齿活髓状态。牙髓中DPSCs具有较强的自我更新及多向分化潜能，是牙髓组织抵御及修复牙髓炎症的基础，因此个体中DPSCs的增殖能力及成牙成骨向分化能力势必会影响活髓保存治疗的效果。糖尿病是目前发病率较高的代谢性疾病，糖尿病患者易发生牙周炎及骨代谢疾病，这与糖尿病状态下牙周膜干细胞及骨髓间充质干细胞增殖能力及成牙成骨向分化能力的降低，使牙周组织及骨组织修复能力降低有关。故本实验主要探讨糖尿病状态下对DPSCs增殖能力及成牙成骨向分化能力的影响。

实验选取的GK糖尿病大鼠是常用的自发性非肥胖非胰岛素依赖2型糖尿病模型，一般于3到4周龄发生明显的糖尿病，但在前期常有一段血糖正常期，3个月龄时为稳定糖尿病高血糖状态。本实验中选取3月龄GK大鼠连续监测餐后2 h尾静脉血血糖值平均稳定在20.1～22.3 mmol/L，而正常对照组Wistar大鼠血糖正常[6]，平稳一周后用于实验。分离培养DPSCs后通过MTT试验检测发现糖尿病大鼠DPSCs增殖能力明显较正常大鼠低，显示了糖尿病状态下会抑制DPSCs的生长。有研究表明，高糖微环境下可能会抑制细胞对氧化应激的适应性反应，从而促进活性氧清除，引起干细胞增殖能力的降低[7,9]。此外有文献报道高糖状态可以通过激活糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)来抑制细胞周期素D1和趋化因子-4来降低骨髓间充质干细胞的增殖能力[10]。

[2]　Wang Y, Zheng Y, Wang Z, et al. 10-7 M 17β-oestradiol enhances odonto/osteogenic potency of human dental pulp stem cells by activation of the NF-κB pathway[J/OL]. Cell Prolif，2013，46(6)：677-684[2017-11-16]. http://dx.doi.org/10.1111/cpr.12071.

检测结果显示在培养3 d及5 d后GK-DPSCs OD值较对照组低，差异具有统计学意义(P<0.05)；在培养第7天时，GK-DPSCs OD值较对照组明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)(图2)。

[参　考　文　献]

[1]　Gronthos S, Mankani M, Brahim J, et al. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo[J/OL]. Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97(25)：13625-13630[2017-11-16]. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.240309797.

在本研究中Osx是Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor-2，Runx2)的下游基因，由Runx2所调控，是成骨向分化的重要调节因子[11]。OCN往往在形成骨组织时高度表达，是成熟骨基质形成的重要标志[12]。DMP1主要在细胞形成牙本质或前期牙本质时表达增加，是成牙向分化的重要指标[13-14]。本研究通过实时定量RT-PCR及Western blot检测两组DPSCs培养7 d后Osx、OCN及DMP1的表达，结果显示GK-DPSCs中相关mRNA及蛋白表达均较对照组低，提示糖尿病大鼠其DPSCs成牙成骨向分化潜能显著降低。有研究发现高血糖状态可以通过激活细胞内核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号转导通路，使其炎症因子白介素(IL)-6及IL-8表达升高，从而抑制了干细胞的成牙成骨向分化能力[7]。而在骨髓间充质干细胞中，高血糖状态显著抑制长链非编码RNA(lncRNA)AK028326介导的趋化因子配体13(CXCL13)表达[6]，从而降低其成骨向分化潜能。高血糖通过何种机制降低DPSCs其成牙/骨向分化需要进一步研究证实。

[6]　Cao B, Liu N, Wang W. High glucose prevents osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells via lncRNA AK028326/CXCL13 pathway[J/OL]. Biomed Pharmacother，2016，84：544-551[2017-11-16]. http://dx.doi.org/10.1016/j.biopha.2016.09.058.

[4]　Wang Y, Yan M, Fan Z, et al. Mineral trioxide aggregate enhan-ces the odonto/osteogenic capacity of stem cells from inflammatory dental pulps via NF-κB pathway[J/OL]. Oral Dis，2014，20(7)：650-658[2017-11-16]. http://dx.doi.org/10.1111/odi.12183.

GK-DPSCs组OSX、OCN、DMP1表达均较对照组明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)(图3)，提示糖尿病状态下DPSCs其成牙成骨向分化能力降低。

[3]　Wang Y, Yan M, Yu Y, et al. Estrogen deficiency inhibits the odonto/osteogenic differentiation of dental pulp stem cells via activation of the NF-κB pathway[J/OL]. Cell Tissue Res，2013，352(3)：551-559[2017-11-16]. http://link.springer.com/article/10.1007/s00441-013-1604-z. DOI：10.1007/s00441-013-1604-z.

“国家对重点水污染物实施总量控制制度”（《水污染防治法》），体现了科学性与合理性内涵。陆域（包括工业、农业、生活，或者“点源”、“面源”）的水污染排放，必然在汇流的水体中体现。应该通过“河流物质通量”监测方法获取“入河污染物总量”及其趋势变化，增强水污染治理的针对性与考核评价的可操作性，并为实现水污染“总量控制”从宏观到微观的统一奠定基础。

1.3.4　Western blot检测　细胞培养7 d后分别收集GK-DPSCs及Wistar-DPSCs，，各加入200 μL RIPA蛋白裂解液，冰上30 min，12 000 r/min离心15 min，取上清，考马斯亮蓝法测蛋白浓度，调整蛋白浓度一致，按体积加入5倍蛋白上样缓冲液，混匀，煮沸5 min，-70 ℃储藏备用。根据凯基SDS-PAGE凝胶试剂盒说明，配制10%分离胶和4%浓缩胶，每泳道加蛋白30 μg进行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜上后，5%脱脂奶粉中封闭2 h，封入抗体(OSX，1∶1 000；DMP1，1∶1 000；OCN，1∶500；ACTIN，1∶1 000)，4 ℃过夜；第二天，取出膜，室温复温1 h，用PBST(含0.1%吐温-20的PBS)洗膜3次，每次10 min，再加入二抗(1∶10 000)，室温孵育1 h，PBST摇洗5×10 min，加入化学发光底物，LAS4000系统曝光，图片分析。

[8]　Lamster IB, Pagan M. Periodontal disease and the metabolic syndrome[J/OL]. Int Dent J，2017，67(2)：67-77[2017-11-16]. http://dx.doi.org/10.1111/idj.12264.

[9]　McClelland Descalzo DL, Satoorian TS, Walker LM, et al. Glucose-Induced Oxidative Stress Reduces Proliferation in Embryonic Stem Cells via FOXO3A/β-Catenin-Dependent Transcription of p21(cip1)[J/OL]. Stem Cell Reports，2016，7(1)：55-68[2017-11-16]. http://dx.doi.org/10.1016/j.stemcr.2016.06.006.

那语气像是刚才什么都没有发生似的，我心里七上八下地坐在了萍萍的身边，然后看着林孟拿着一张白纸和一支笔走过来，他和我们坐在了一起，他对萍萍说：“你做了对不起我的事……”

[10] Zhang B, Liu N, Shi H, et al. High glucose microenvironments inhibit the proliferation and migration of bone mesenchymal stem cells by activating GSK3β[J/OL]. J Bone Miner Metab，2016，34(2)：140-150[2017-11-16]. http://dx.doi.org/10.1007/s00774-015-0662-6.

传统的许可等强干涉性的管制模式则人为限定了市场主体的经济活力，容易滋生强权政府以及权力寻租。相反，在负面清单模式下，政府部门的市场管理权限以负面清单为界，同样受负面清单的制约和限制，行政管理部门只能对市场主体违反负面清单的行为予以制裁和惩处。负面清单管理模式虽然放宽了市场主体的市场准入资格，但却更加激发了市场主体的自律意识和自我责任意识，政府不再追求事无巨细的管控，而是通过提供良好的市场运行秩序服务于经济，以“管家婆”身份服务于市场需求。

[11] Lee MH, Kwon TG, Park HS, et al. BMP-2-induced Osterix expression is mediated by Dlx5 but is independent of Runx2[J/OL]. Biochem Biophys Res Commun，2003，309(3)：689-694[2017-11-16]. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2003.08.058.

本文主要选取2008年、2011年(2008年北部湾经济区正式上升为国家级发展战略，2011年是“十二五”的开局之年)这两个标志性年份北部湾经济区四座主要城市的第一、第二、第三产业从业人员数， 通过对上述数据的处理并代入公式进行计算。计算得到产业结构相似度系数如下(若是计算过程中出现负值、零则代表无相关性，则全部以0来表示)：

[12] 段瑞平, 吴凌, 林云锋, 等. 不同成骨诱导作用下骨髓间充质干细胞的基因表达模式[J]. 四川大学学报(医学版)，2006，37(6)：856-859.

据了解，“粮丰”专项进园区正有序推进，各项目核心示范面积累计约26万亩，辐射面积1433万亩，培训农民139414人次，培训农技人员3708人次，示范技术和产品388个，示范品种255个，取得了显著的经济效益、社会效益。

老男人突然睨向我，目光中，有着一股杀气，他又看向墙角的一摞子砖。想拼命啊！此时，老男人的狼狗也汪汪汪地叫了起来，到底是忠实的“奴仆”，很明了主人的心思。

[13] Wu G, Deng ZH, Fan XJ, et al. Odontogenic potential of mesenchymal cells from hair follicle dermal papilla[J/OL]. Stem Cells Dev，2009，18(4)：583-589[2017-11-16]. http://dx.doi.org/10.1089/scd.2008.0066.

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