健康志愿者口腔样本的微生物宏基因组学研究

口腔拥有特定的解剖结构及生理位置，其中包含数百种与口腔和全身系统疾病相关的微生物[1]。口腔中微生物群落结构的变化，包括微生物种类、相对丰度的变化都有可能引起口腔微环境的改变，进而成为口腔疾病的始动因子之一。人体表面和体内寄居的微生物总数至少超过人体细胞总数一个数量级[2]，大量的微生物构成人体各部位的微生物群落。通过不同基因组测序及实验，学者们认为健康人口腔中可能存在一个共同的口腔微生物基因组，它表达的是口腔环境中所有微生物表达基因组合集中的共同基因组部分，也称为“元基因组”或“核基因组”(core microbiom)[3]。研究显示，健康口腔中可能存在微生物“元基因组”[4]。同时，在慢性牙周炎、种植体周围炎、种植体周围黏膜炎等疾病菌斑样本中也发现各自的微生物“核基因集”[5]。本实验旨在通过以第二代高通量测序技术、总DNA提取等技术支持下的宏基因组学方法，探寻健康志愿者口腔样本的微生物群落，为后续研究健康及疾病状态下口腔微生物群落结构差异，探寻口腔疾病(如牙周炎、种植体周围炎等)病因，及早期精准筛查、诊断、预防等进行初步基因组学探索。

1　资料与方法

1.1　一般资料

选取4名年轻的口腔健康志愿者(2男，2女)，年龄(22±1.5)岁；无慢性牙周炎、牙龈炎、龋病、牙髓疾病、黏膜系统疾病等口腔疾病，口内余留牙数目大于等于28颗；无高血压、糖尿病等全身系统性疾病，3个月内无用药史及牙周基础治疗史。志愿者知情同意并签署知情同意书。

1.2　方法

1.2.1　唾液样本采集　志愿者清水漱口1 min后，隔湿下前牙舌侧牙面，低头2 min，用无菌一次性吸管取约1 mL口底唾液，置于1.5 mL无菌EP管中，-80 ℃冻存。

1.2.2　牙菌斑样本采集　志愿者清水漱口1 min后，隔湿磨牙唇(颊)侧及舌(腭)侧，使用自制灭菌探针刮取龈上菌斑，使用无菌牙周刮治器刮取龈下菌斑，注意避免损伤牙龈，将刮取的菌斑样本分别置入含无菌双蒸水的1.5 mL无菌EP管中，-80 ℃冻存。

1.2.3　分组编号　按照样本采集部位将样本分为3组：健康龈上菌斑样本组、健康唾液样本组、健康龈下菌斑样本组，每组4个样本。

1.2.4　测序和分析　12个样本干冰运输至深圳华大基因研究院，提取总DNA后构建样本基因文库，通过华大测序平台BGI Seq500进行测序，测序结果转换成的.fg文件，使用注释软件进行物种注释，样本的微生物门、属及各微生物门属所占的平均相对丰度比(分别计算单个样本的各微生物门相对丰度比10次，并取均值)，使用直方图展示。

利用EDEM的后处理模块在仿真模型中划分统计区，统计在吸尘孔内分区的煤尘以及岩尘颗粒累积质量，进而计算出其除尘率，其中统计区内煤尘累计质量如图4所示。

1.3　统计学分析

近年来，精准医疗成为口腔医学的研究热点，口腔疾病的精准筛查、诊断、治疗仍存在一定的困难[10]，但随着高通量测序技术的改革及其检测基因长度能力的提高，利用该平台研究复杂样本的微生物群落结构已成为可能。在后续的口腔微生物基因组学研究中，通过增大样本量，可以分别研究健康口腔志愿者的口腔微生物群落结构、其“核基因集”以及病因复杂的口腔疾病，如慢性牙周炎、龋病等患者的口腔微生物群落结构、“核基因集”等。在分别研究与口腔疾病可能有关的微生物群落结构基础上，探讨可能与疾病相关联的口腔微生物群落，从而为后续深入研究可能致病微生物基因集以及在这一基础上设计精准药物治疗疾病、改善疾病预后。同样，在大样本深入研究口腔微生物群落结构的基础上，可以为患者、口腔健康者建立口腔微生物基因集“档案”：采集不同时期个人口腔样本、进行基因组提取及测序分析，可以从宏观层面研究口腔健康与疾病的微生物群落结构差异、患病机制等，进而在早期诊断、精准用药、微生物治疗甚至达到以微生物群落结构检测前提的早期预防目的，从全新的角度进行口腔疾病的治疗。

[2]　Xiao C, Ran S, Huang Z, et al. Bacterialdiversity and community structure of supragingival plaques in adults with dental health or caries revealed by 16S pyrosequencing[J/OL]. Front Microbiol，2016，7：1145[2017-12-29]. http://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2016.01145.

2　结　果

2.1　微生物门分类结果

跟追纠缠等一连串之侵扰行为可能带来的后果，不仅仅只是侵害被害人人格权、隐私权，甚至身体健康也受影响，有关机关必须尽速进行防制专法之立法。对于跟踪骚扰问题，台湾现行法规欠缺有效的法律加以制止，相关人员对于跟踪行为之本质、样态、辨识指标及因应策略等知能尚在起步阶段，协助跟踪骚扰被害人仍力有未逮。因此，应该持续关注属于性别暴力之跟踪相关政策与实务议题，从媒体倡导、专业培训与法令推动加以着手。同时希冀支持“防制跟追纠缠”之立法，以具体规范和防制社会中之跟踪骚扰问题，促使民众的人身安全与自由、隐私及尊严得以获得进一步保障，并能为跟踪被害人发声，争取并保障被害人权益。

消能墩布置在消力池内，它的作用是促使水流进一步扩散、相互撞击，增强了水流的紊动，从而达到增加消能的效果，同时减少了消力池深度和长度。

健康志愿者口腔唾液样本及龈上、龈下菌斑样本中均可检测到5种微生物门，包括放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、变形菌门。将各组样本的微生物门分类注释结果及其各微生物门所占平均相对丰度比用直方图形式展示(图1)，同时统计各样本组中各微生物门分类平均相对丰度比(表1)。

统计学分析显示：龈上菌斑样本组中拟杆菌门平均相对丰度比高于龈下菌斑样本组，差异有统计学意义(P<0.05)；龈上菌斑样本组中厚壁菌门平均相对丰度比低于龈下组，差异有统计学意义(P<0.05)；龈上菌斑样本组中拟杆菌门平均相对丰度比高于口腔唾液样本组，差异有统计学意义(P<0.05)；唾液样本组中放线菌门、厚壁菌门平均相对丰度比高于龈上菌斑样本组中放线菌门、厚壁菌门平均相对丰度比，差异有统计学意义(P<0.05)；唾液样本中变形菌门的平均相对丰度比低于龈下菌斑样本组的变形菌门平均相对丰度比，差异有统计学意义(P<0.05)。

 

A：健康龈上菌斑样本组；B：健康唾液样本组；C：健康龈下菌斑样本组；横坐标代表单个样本，纵坐标代表各样本微生物门所占平均相对丰度比(%)

 

图1　健康志愿者口腔各样本组微生物门分类及平均相对丰度比Fig.1　Average relative abundance of each samplein different Phylum group表1　各组微生物门分类平均相对丰度比Tab.1　Average relative abundance of differentPhylum group　(%)

  

龈上菌斑唾液样本龈下菌斑放线菌门16.3026.5015.20拟杆菌门7.604.382.80厚壁菌门18.9034.4046.35梭杆菌门4.501.001.80变形菌门14.102.001.40

2.2　微生物属分类结果

对三组样本的口腔微生物各属分类及其各组中各微生物属所占平均相对丰度比进行统计(表2)，结果显示：龈上菌斑样本组中链球菌属平均相对丰度比低于龈下菌斑组、多形杆状菌属平均相对丰度比高于龈下菌斑样本组，差异有统计学意义(P<0.05)；唾液样本组中副球菌属、粪杆菌属的平均相对丰度比高于龈上和龈下菌斑样本组，差异有统计学意义(P<0.05)；唾液样本组中普氏菌属及放线菌属平均相对丰度比低于龈下菌斑样本组，差异有统计学意义(P<0.05)。

三系杂交种皖芝10号参加2013年安徽省芝麻新品种区试，产量为1 498.50 kg/hm2，比对照品种豫芝4号增产2.04%，2014年通过安徽省鉴定。2015—2016年全国(江淮片)芝麻品种区域试验，两年平均产量1 261.65 kg/hm2，比豫芝4号(CK)增产2.54%；含油量为58.18%，蛋白质含量20.97%；茎点枯和枯萎病病情指数分别为5.07和0.85。该品种具有优质、高油、高产、多抗、综合性状优于全国对照品种豫芝4号等特点，适合制油、食品保健。

从唾液样本组中获得15个微生物属，龈上、龈下菌斑样本中可获得19个微生物属，且从健康志愿者的单个龈下菌斑样本中可检测到低丰度的真杆菌属(0.33%)。

 

表2　各组微生物属分类平均相对丰度比Tab.2　Average relative abundance of differentPhylum group　(%)

  

龈上菌斑唾液样本龈下菌斑韦永氏菌属2.000.908.17链球菌属6.817.4012.27月形单胞菌属0.620.000.93普氏菌属1.600.003.13卟啉单胞菌属0.750.000.467副球菌属3.506.403.37奈瑟氏菌属0.350.251.03嗜血杆菌属2.106.901.43梭菌属6.404.305.80粪杆菌属6.3014.006.33弯曲菌属0.600.200.56伯克霍尔德菌属4.458.404.23多形杆状菌属0.700.200.53伴放线菌属2.100.202.00放线菌属13.881.3015.20真杆菌属0.000.000.33消化链球菌属0.250.100.80颗粒链菌属0.150.200.53兼性双球菌属0.050.300.23小杆菌属0.150.001.00

3　讨　论

唾液是龈沟液、黏膜渗出液、唾液腺腺泡超渗液的混合体，储存了大量的人类和口腔微生物的基因信息，唾液中还含有口腔局部组织和身体其他部位感染微生物和病毒的RNA和DNA[6]。龈上菌斑、龈下菌斑中微生物种类繁多，且与各种口腔疾病甚至全身疾病关联密切[7]，研究口腔微生物群落结构具有十分重要的意义。

本实验通过微生物宏基因组学方法，对口腔唾液样本、龈上菌斑样本以及龈下菌斑样本进行高通量测序，结果显示健康志愿者口腔中唾液样本、龈上菌斑样本、龈下菌斑样本中均存在微生物多样性，各样本组中个别微生物种属的微生物门、属平均相对丰度比也存在不同程度的差异，进一步说明健康志愿者唾液、龈上菌斑、龈下菌斑中可能存在“元基因组”或“核基因组”。

随着测序平台大数据处理能力的提升，研究口腔微生物样本群落多样性将更加经济、有效，进而有望推动口腔疾病的早期精准筛查、诊断及预防，改善患者口腔疾病治疗预后，提高患者生活质量[11]。

本实验采集了4个健康年轻人口腔微生物标本进Illumina高通量测序，来验证人类口腔微生物数据库[8](Human Oral Microbiome Database，HOMD)收录的微生物种属，从提取纯化后扩增所得的微生物基因序列(基因文库)中识别出24个口腔微生物种属，其中常见微生物厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、链球菌属，与HOMD收录的微生物种属一致。与Lazarevic等[9]从3个健康志愿者口腔样本中获得的常见菌属(厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、梭菌属)基本一致，而后者中少见拟杆菌门，出现这一差别的原因可能有人群口腔样本的变异、样本数量较小以及信息偏倚。

使用SPSS 18.0软件进行统计学分析，通过单因素方差分析对各组实验数据均值进行比较，记录实验结果。

3.市场监管应注重对金融消费者的利益保护。一个期货期指的定价、估算以及波动情况是需要严密精细的计算以及长时间跟踪调查的，这是金融衍生产品自身的特性，对于消费者来讲他们并不能及时掌握一手信息、也没有能力对错综复杂的信息做出精准判断。因此在金融衍生产品领域，消费者保护的意义是值得突出强调的。

[参　考　文　献]

[3]　Maruyama N, Maruyama F, Takeuchi Y, et al. Intraindividual variation in core microbiota in peri-implantitis and periodontitis[J/OL]. Sci Rep，2014，4：6602[2017-12-29]. http://dx.doi.org/10.1038/srep06602.

图2B和表2示，不同分化程度肿瘤组织中CEACAM1表达方式差异有统计学意义，分化程度低的腺癌组织CEACAM1细胞质表达较多，χ2=8.649，P=0.013。中晚期食管腺癌组织样本中CEACAM1细胞膜表达较少，细胞质表达较多，与早期食管腺癌组织相比(以细胞膜表达为主)，差异有统计学意义，χ2=25.410，P<0.001。

[1]　Takeshita T, Kageyama S, Furuta M, et al. Bacterial diversity in saliva and oral health-related conditions: the Hisayama Study[J/OL]. Sci Rep，2016，6：22164[2017-12-29]. http://dx.doi.org/10.1038/srep22164.

[4]　Jiang Y, Xiong X, Danska J, et al. Metatranscriptomic analysis of diverse microbial communities reveals core metabolic pathways and microbiome-specific functionality[J/OL]. Microbiome，2016，4：2[2017-12-29]. http://dx.doi.org/10.1186/s40168-015-0146-x.

[5]　Davis EM. Genesequence analyses of the healthy oral microbiome in humans and companion animals[J/OL]. J Vet Dent，2016，33(2)：97-107[2017-12-29]. http://dx.doi.org/10.1177/0898756416657239.

[6]　程兴群, 邓盟, 徐欣, 等. 唾液和唾液组学与疾病早期诊断[J]. 国际口腔医学杂志，2014，41(2)：213-219.

(5)在是否对接资本市场方面，所有被调研高校均做的不好。反映了高校大学生创业与资本市场的对接还存在着困难。

[7]　杨懋彬, 周学东. 牙菌斑与全身疾病的关系[J]. 国外医学·口腔医学分册，2005，32(1)：55-57，60.

[8]　Chen T, Yu WH, Izard J, et al. The Human Oral Microbiome Database: a web accessible resource for investigating oral microbe taxonomic and genomic information[J/OL]. Database (Oxford)，2010，2010：baq013[2017-12-29]. http://dx.doi.org/10.1093/database/baq013.

[9]　Lazarevic V, Whiteson K, Huse S, et al. Metagenomic study of the oral microbiota by Illumina high-throughput sequencing[J/OL]. J Microbiol Methods，2009，79(3)：266-271[2017-12-29]. http://dx.doi.org/10.1016/j.mimet.2009.09.012.

[10] 马姝祺, 周秦. 口腔微生物组学与口腔个体化医疗研究进展[J]. 临床口腔医学杂志，2016，32(10)：633-635.

[11] 徐欣, 郑欣, 郑黎薇, 等. 口腔精准医学：现状与挑战[J]. 华西口腔医学杂志，2015，33(3)：315-321.

[8]兰平：《汉学“典范大转移”与“新汉学”的来龙去脉——陈珏教授访谈录》，《文艺研究》2014年第10期。