重组大肠杆菌表达外源蛋白包涵体复性的研究进展

随着以基因工程为核心的生物技术的飞速发展，利用基因重组技术生产难于用传统工艺生产的生物医药制品，如疫苗、免疫制剂、单克隆抗体等，在疾病的诊断、预防和控制，保护人畜健康方面发挥着十分重要的作用。大肠杆菌原核表达系统，是生产重组蛋白的首选表达体系。

外源基因在细胞中进行高表达时，会形成包涵体，因包涵体属于高密度、不溶性蛋白颗粒，故没有生物学活性，需经过复性后方可恢复蛋白的生物学活性。因此，包涵体蛋白质的复性是重组蛋白生产的关键技术，在基因工程产品的规模化生产中意义非凡。

1 包涵体如何形成及变性

包涵体，也就是通常所说的无活性蛋白聚集体，它是在重组蛋白表达时候形成的。重组蛋白含量达到50%以上，其他成分主要有一些杂蛋白（如RNA聚合酶、核糖体组分、外膜蛋白等）、质粒DNA、RNA片断和脂质、肽聚糖、脂多糖等成分[1]。

1.1 包涵体形成原因

通常情况下认为，包涵体的形成主要有以下几方面原因：一是宿主的代谢水平会受到重组蛋白高表达的影响，蛋白没有充足的时间用于折叠；二硫键的形成受到宿主细胞内环境的影响[2]，或者因为二硫键不能正确配对，形成非特异性蛋白的结合，造成蛋白质溶解度不够；二是重组蛋白的氨基酸组成有差异。一般来看，含硫氨基酸和脯氨酸的含量都与包涵体的形成呈明显的正相关。三是环境因素，如重组蛋白所处的环境温度、培养基的成分、酸碱度、离子强度等都可影响包涵体的形成，有研究发现，温度与包涵体形成呈正相关，培养基养分不足时，包涵体也容易形成。四是重组蛋白在真核生物中翻译后修饰需要相关酶类(如糖基化等)，但因其是大肠杆菌的异源蛋白，缺少这种酶类，造成积累大量的中间体，从而形成包涵体沉淀。五是细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的化学作用促使包涵体形成[3-4]。

1.2 包涵体的优缺点

在利用基因工程菌生产重组蛋白中，包涵体蛋白并不会因为其不具有天然结构和活性而丧失优势，反倒具有以下几个优点：包涵体结构致密，大肠杆菌蛋白酶不一定能降解它；重组蛋白会进行高表达[2]；重组蛋白在包涵体达到一定密度（1.3mg/ml） [5]时，纯度较高，方便以后对其分离和纯化；有些蛋白处于天然构象，会对宿主细胞产生毒害，包涵体的形成则易于这类膜蛋白和毒性蛋白的表达[6]；胞质中的重组蛋白浓度在形成包涵体后就会降低，这对目的基因的表达十分有利。

包涵体的复性是指在一定的氧化还原条件下,通过有效方法除去变性剂，使无活性蛋白质恢复活性的过程。普遍应用的复性方法，如稀释复性、透析复性和超滤复性，复性活性的回收率较低，且杂蛋白分离的难度较高。稀释法复性处理量太大，不利于工业生产时放大；超滤法复性容易造成膜污染；透析法复性所需时间太长，而且容易形成没有活性的蛋白质聚集体，因此学者们又研究出了层析复性、反胶团复性等其他新型、高效的复性方法。

混合强度、变性蛋白流加速率、变性蛋白浓度、终蛋白浓度等是影响稀释复性效率的主要因素。有研究表明，用50倍体积两次稀释复性IL-2，可使复性得率达到52%，但操作体积较大、蛋白浓度较低，会为后续纯化带来一定难度。

1.3 包涵体的变性

溶解包涵体前需对其进行分离洗涤处理，以除去脂多糖、核酸、脂类和其他杂蛋白[7]。分离首先进行菌体的收集、洗涤。通常采用超声破碎、裂解液处理法、高压均质法对菌体进行破碎，再用盐酸胍等低浓度变性剂、Triton X-100等弱去污剂、β-巯基乙醇等还原剂和EDTA等的溶液进行洗涤。通过以上处理后，包涵体的目的蛋白含量能超过60%。还需再用高浓度的变性剂（如尿素，盐酸胍等），同时加入还原剂（如巯基乙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸等）进行再次溶解，以此达到破坏蛋白质内部和之间二硫键的目的。接着对致密的包涵体、其余密度较小的细胞膜组分和可溶杂质进行分离。最后，经过简单的洗涤来除去一些杂质。为了提高包涵体的纯度，分离过程中还常常添加去污剂，核酸酶，低浓度尿素等。

将变性蛋白直接稀释于复性液中的复性方法称为稀释复性。这种复性方法最简单、有效。稀释复性很容易操作、放大和操控，所以在生物医药行业和科学研究领域被广泛运用。稀释复性的蛋白终浓度一般控制0.01mg/ml以下，这是为了防止形成大量的蛋白沉淀和提高可溶性收率。

2 包涵体的复性方法

包涵体蛋白的缺点是必须先变性，再复性，才能恢复重组蛋白生物活性。

2.1 稀释复性

给出一个训练集Τ={(xi,yi),i=1...l}，其中xi∈RN,yi∈R，在特征空间F 中构造一个线性回归方程：

在车辆停放静止状态下，取电缆上的任意一点O进行受力分析(见图1),该点所受力分别为P、T、G。其中，G表示线缆重力;P、T分别沿线缆轴线切线方向，设P、T与水平线的角度分别为α、β。

965 Early secondary prevention of cardiogenic stroke caused by atrial fibrillation

2.2 透析复性

最近研究较多并成功应用于生产中的一种复性方法就是将层析技术应用于蛋白质复性的层析复性法。通常所用的层析方法主要有离子交换层析法、体积排阻层析法、亲和层析法和疏水层析法这四种。上述方法的共同之处是具有比较温和的复性条件；蛋白因为被层析介质分隔开来，所以不容易发生聚集；变性剂的浓度也可通过线性洗脱而降低；蛋白的复性和纯化可以同时实现，节约了时间。但是，在进行溶液交换的过程中，凝胶介质上会有变性蛋白会聚集产生的沉底物质吸附在上面，使得复性率和柱子载样量降低。

2.3 超滤复性法

“我们以前都不知道他如何应付10个女人呢。”普京说。此言一出，顿时引来一阵会心的大笑。而奥尔默特接下来话的也颇有弦外之音：“如果我是你，我就不会羡慕他。”

2.4 层析复性

透析复性是实验室中常用的一种方法，主要包括一步透析和多步透析两种，最常采用的是多步透析[8]。透析过程中，通过逐步降低外部复性液中变性剂的浓度，使透析袋内部变性剂的浓度也逐渐降低。与稀释复性相比，这种方法能够在一定程度上提高蛋白质的复性效率。有研究表明，白介素IL-2进行六次透析复性后，得率可以达到50%，但透析过程会耗时36 h，消耗透析外液5 L，与耗时24 h、消耗100 ml复性缓冲液的稀释复性法相比，透析复性的工艺周期更长，试剂消耗量更大。因此，透析复性具有不增加体积的优点和易形成无活性蛋白质聚体、不适合大规模操作、耗时长的缺点。

在高浓度蛋白条件下进行包涵体复性时，常使用外加压力差，加速变性剂去除的超滤复性法。研究者对蛋白浓度为1.0 mg/ml的重组人粒细胞集落刺激因子rhG-CSF采用恒体积超滤复性法后，复性得率为51.0±2.6%、比活为1.51±0.08×108 IU/mg，这比相同条件下采用稀释复性方法，复性得率和比活分别提高了45%和200%以上。由于超滤复性具有规模大，耗时少的特点，因此比较适合工业化生产中应用，但有些蛋白可能在应用此法复性时，发生不可逆的变性，所以在样品量较少的情况下不推荐使用超滤复性。

与传统复性方法对比来看，层析复性法去除变性剂所用时间非常短，变性的蛋白质分子很少发生聚集，故其活性回收率得到提升，蛋白质复性时，目标蛋白与杂蛋白分离开来，使得目标蛋白纯度更好，复性质量更好。

2.5 反胶团复性法

将有机溶剂添加到水溶液后，表面活性剂就会形成水相液滴，将其称为反胶团，微团中表面活性剂极性头部向内，当折叠的蛋白进入有反胶团的溶液后，蛋白就会镶嵌在反胶团上与活性剂的极性头作用，进行复性。蛋白变性溶解后就通过相转移进入到反胶团中，再将缓冲液进行交换，逐渐去除反胶团中的变性剂，然后氧化还原剂的加入，会使已经发生变性的蛋白重新形成天然构象，再将复性蛋白抽提到水相溶液中。

2017年1月—2018年6月门诊收治的68例脑梗塞患者，患者均符合1995年全国第四届脑血管病学术会议对于脑梗塞疾病诊断标准，经过头颅CT确诊。按照收治时间将以上患者分为观察组及对照组，每组34例。观察组男性患者20例，女性患者14例年龄32～70岁，平均（52.3±8.0）岁，对照组男性患者18例，女性患者16例，年龄35～75岁，平均（55.3±7.5）岁，分析两组患者一般资料差异不显著。本次临床用药患者均知情同意，治疗方案经过我院院办认可。

形成反胶团以及促使变性蛋白进入微团，需要具备相当严苛的条件，也只有极少数量的蛋白质能够应用此法进行复性。蛋白复性所需要的环境很难与微团内的微环境吻合，因此反胶团复性法在实际应用中，很难操作。

蛋白的体外复性一度被认为是一项异常艰巨的任务，包涵体形成后通过变性、复性，最终获得有活性的蛋白的过程是非常复杂的。虽然有各种方法使包涵体蛋白完成复性，但是不同蛋白需要不同的方法，这使得操作和应用起来不方便，因此，研制操作简单、成本低、耗时短、活性蛋白得率高的蛋白复性方法是十分必要的，大肠杆菌表达系统能够实现重组蛋白的高表达，如果设计出高效的复性方法，将会给科研、医疗和工业生产大量蛋白提供一个十分有效的途径。

参考文献：

[1]王亚辉,辛爱洁,李素霞,等.包涵体蛋白质的品质[J].生命的化学,2009,29(4):609-613.

[2]Singh SM,Panda AK.Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins[J].Journal of Bioscience & Bioengin eering,2005,99(4):303-310.

[3]Ejima D,Watanabe M,Sato Y,et al.High yield refolding and purification process for recombinant human interleukin-6 expressed in Escherichia coli[J].Biotechnology & BioEngineering,1999,62(3):301-310.

[4]Kojima S,Miyoshi K,Miura K,Synthesis of a squash-type protease inhibitor by gene engineering and effects of replacements of consereved hydrophobic amino acid residues on its inhibitory activity[J].Protein Engineering,1996,9(12):1241-1246.

[5]Taylor G,Hoare M,Gray D,et al.Size and Density of Protein Inclusion Bodies[J].Nature Biotechnology,1986,4(6):553-557.

[6]龚平生,罗贵民.包涵体复性研究进展[J].中国生物工程杂志,2003,23(12):73-77.

[7]Jungbauer A,Kaar W.Current status of technical protein refolding[J].Journal of Biotechnology,2007,128(3):587-596.

[8]Peterson M J,Syder W K,Westerman S,et al.Preparative Protein Production from Inclusion Bodies and Crystallization:A Seven-Week Biochemistry Sequence.[J]Journal of Chemical Education,2011,88(7):986-989.