Ⅰ群禽腺病毒4型Penton基因的克隆及原核表达

禽腺病毒属于腺病毒科[1]，根据其抗原结构不同分为3个群，Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus group Ⅰ,FAV Ⅰ)有12个血清型(FAdV1～12)[2]，Zsak等将Ⅰ群禽腺病毒划分为A～E 5个基因型[3]，是禽类常见的传染病病原。腺病毒感染的主要临诊症状表现为心包积水、包涵体肝炎，继而出现呼吸道感染、出血性肠炎和产蛋量减少等症状，具有高发病率和高死亡率的特性[4]。近些年来，我国较多省份暴发了该病,给我国禽类养殖业造成了严重的经济损失[5-9]。

尽管禽腺病毒对我国禽类的侵害已引起一定的重视，但是Ⅰ群禽腺病毒血清型众多，各血清型对禽类的致病方式各不相同。而通过对近些年的研究调查发现，对于Ⅰ群禽腺病毒4型的研究并不充分，且Penton蛋白作为禽腺病毒的主要结构蛋白，携带有主要的种特异性抗原决定簇和次要的属特异性抗原决定簇，可与细胞表面的病毒受体结合,在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用[10-11]。因此，对Penton基因的功能与特性进行深入的研究，将有助于对禽腺病毒致病机理的探索。迄今为止，国内尚未见有Ⅰ群禽腺病毒Penton基因可溶性原核表达的研究。本研究通过对Penton基因进行原核表达和纯化，获得了高表达量、高纯度，且具有生物学活性的可溶性蛋白，为诊断试剂、抗病毒药物及疫苗的制备奠定了基础。

王定华司长从“立德树人”的出处讲起，引用《左传》《管子》中的“立德、立功、立言”等论述，强调当今师德建设的重要性；石中英教授把儒家文化和西方哲学相比较，从本体论和人性论的角度来分析教师德行；柳袁照校长则从自身的办学实践出发，以莫言和高考作文为例，讲了传统诗性文化的坚守在教师德育建设中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源与鸡胚 Ⅰ 群禽腺病毒血清4型毒株(SX17)由西北农林科技大学动物医学院兽医公共卫生学实验室分离、鉴定并保存；SPF鸡胚购于北京梅里亚维通有限公司。

(2)为什么称f(x)为密度函数呢？物理中，一根不均匀的细棒已知线密度如何求其质量？单位长度的铁棒质量与密度有什么关系？学生对这一问题非常熟悉，当然是密度越大，质量越大。那么概率密度也具有这样的特点，密度越大，概率越大。因此区间长度一定，f(x)取值越大，则随机变量的取值落在该区间的概率值越大。通过引导学生将概率密度和物理中的密度相类比，来理解密度函数的意义。

以陕西分离株SX17基因组DNA为模版，PCR扩增Penton的基因序列，基因片段经8 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，图1中可见出现大小约为1 578 bp的特异性条带，与预期相符。

2.3.2 尔雅通识课程学习效果情况。尔雅通识课程以网络在线教学为依托，学生在规定的教学周内自主制定学习计划，通过观看教学视频、完成课堂测验、参与提问、讨论及参加考核等方式进行学习，教学视频和课堂测验总共完成达到80%方有资格参加考试。尔雅通识课程成绩由四部分组成，即视频学习（30%）+课堂测验（35%）+访问数（5%）+考试成绩（30%），成绩达到60分即为合格可获取相应的学分，否则需要重修或者选修其他课程获取学分。2016—2017学年第二学期的学习结果统计分析显示，开设185门课程，1 360人次获得考试资格，最终1 346人次获得学分，通过率达99%。

1.2 方法

1.2.6 Penton蛋白的提取及纯化 将重组载体转入表达菌，挑单克隆，培养并扩大至200 mL，37℃振荡培养至OD600 nm=0.4～0.6，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，15℃诱导表达18 h，收菌后加重悬液10 mL，超声破碎12 min，12 000 r/min离心15 min，上清上1.5 mL Ni-NTA，10 mmol/L咪唑buffer洗10 mL，0.5 mol/L咪唑buffer洗脱1.5 mL×3。Penton镍柱洗脱产物加SUMO酶酶切并透析降盐(buffer：20 mmol/L Tris-HCl pH8.5，0.2 mol/L NaCl，1 mmol/L DTT，100 mL/L甘油)。透析后再次穿过Ni-NTA去除酶和杂蛋白，穿出后样品上HiTrap Q 1 mL柱，AKTA primeplus仪器0.8 mL/min梯度洗脱，10 g/L SDS-PAGE凝胶检测。

3) Özgökme等[7]基于Leeway模型和拉格朗日模型建立的海上不规则流场下的物体漂移轨迹预测模型，研究风场和流场密度对预测精度的影响。ZHANG等[8]建立同构流场下失踪物体漂移轨迹预测概率模型，通过风速和流速的预测不断更新物体的位置，仿真结果表明该模型具有较高的精度和可靠性。

从 R-CNN[14]到 Fast R-CNN[15]再到 Faster RCNN[16]一直采用选择性区域提取[17]与CNN代替传统目标检测使用的滑动窗口与手工设计特征，这使得目标检测效率得到了的大大的提升。但针对实时的ATM机场景检测速率仍然不够，因而本文运用了改进的YOLO单一人脸检测模型，利用回归方法进行人脸定位，具有快速定位目标人脸的效果。

1.2.3 Penton全基因序列分析 将鉴定正确的pCold-SUMO-Penton质粒送公司测序，通过DNA Star软件的SeqMan程序对测序结果进行拼接整理，将拼接得到的序列上传NCBI，从GenBank中下载Ⅰ群禽腺病毒相关毒株的基因序列，并利用DNA Star与MEGA5.0软件进行同源性分析及系统进化分析。

为了进一步确定SX17毒株的遗传演化情况，应用MEGA5.0软件构建SX17株Penton基因的核苷酸序列进化树(图3)，SX17毒株与国内的毒株具有密切的亲缘关系，位于同一分支，与国外的毒株亲缘关系较远，分属于不同进化分支。

1.2.5 Penton蛋白的Western blot鉴定 SDS-PAGE电泳后，整齐切下目的条带与相邻条带的凝胶，用硝酸纤维素膜设置电压100 V湿转2 h，转膜结束后用50 g/L的脱脂奶粉封闭2 h，抗His标签鼠单克隆抗体4℃过夜孵育，TBST洗去一抗后，一定比例羊抗鼠二抗室温孵育1 h，TBST洗去二抗后，DAB显色试剂盒显色后，于成像仪中观察结果。

1.1.3 主要试剂 基因组DNA提取试剂盒、DNA连接酶购自TaKaRa生物公司；抗His标签鼠单克隆抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司；限制性内切酶购自NEB生物公司。

1.2.1 病毒的增殖 将本实验室保存的毒株经卵黄囊接种于6日龄SPF鸡胚，进行病毒扩增。基因组DNA的提取参照基因组DNA提取试剂盒的说明书操作。

2 结果

2.1 Penton基因RT-PCR 扩增克隆

1.1.2 质粒与菌株 pCold-SUMO载体由本实验室保存；大肠埃希菌DH5α感受态细胞、Rosetta(DE3)感受态细胞购自北京博迈德生物技术有限公司。

M.DNA标准DL 5 000；1.阴性对照；2.Penton基因PCR产物

M.DNA Marker DL 5 000; 1.Negative control; 2.PCR products of Penton gene

图1 Penton基因PCR扩增结果

Fig.1 PCR amplification result of Penton gene

2.2 重组质粒pCold-SUMO-Penton酶切鉴定

回收后的Penton基因片段与pCold-SUMO载体双酶切后连接，转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，HindⅢ和XbaⅠ双酶切鉴定重组质粒，经8 g/L琼脂糖凝胶电泳分析(图2)，与预期结果相符，显示重组表达质粒pCold-SUMO-Penton构建正确。

2.3 Penton基因的序列分析

将测序获得的各个序列进行拼接，结果显示SX17株Penton基因的完整开放阅读框由1578个核苷酸组成，共编码526个氨基酸，同时将SX17株Penton全基因序列信息上传GenBank数据库(登录号为MF592716)。通过DNA Star的MegAlign软件对FAdV SX17株与GenBank参考毒株Penton蛋白基因的序列同源性分析，结果显示SX17株Penton基因与国内的Ⅰ群禽腺病毒C亚群血清4型毒株有较近的起源关系，与HLJDAd15、HN15011等国内参考毒株的核苷酸序列同源性达到99.9%～100%，根据核苷酸序列推导的氨基酸序列同源性则均为100%，相较之下与国外的毒株同源性较低，核苷酸序列同源性为98.8%～99.8%，氨基酸序列同源性为98.5%～99.6%。

1.2.2 Penton全基因原核表达载体的构建 根据GenBank(KU569296.1；KU558761.1；KU587519.1；KX061750.1；KX090424.1；KM096544.1)已公布的Penton全基因设计引物，引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司杨凌实验室合成。上游引物序列为：TTCAAGCTTATGTGGGGGTTGCAGCCG(下划线为HindⅢ酶切位点)；下游引物序列为：CTATCTAGACTACTGCAAGGTCGCGGA(下划线为XbaⅠ酶切位点)。以陕西分离株基因组DNA为模板，扩增Penton全基因片段并回收纯化PCR产物，与pCold-SUMO载体双酶切处理后，连接，转化大肠埃希菌DH5α 感受态细胞，筛选阳性克隆。菌液PCR鉴定为阳性的用碱裂解法抽提重组质粒，并对其进行双酶切验证和测序鉴定，均验证无误后，命名重组质粒为pCold-SUMO-Penton。

试点地区高度重视水资源监控能力建设，完善监控体系，为最严格水资源管理各项工作提供基础保障。上海市依托水务一体化管理优势，在已建成的城市水资源实时监控与管理系统基础上，整合共享其他部门数据，建成了集气象、海洋、水利、供水、排水等信息于一体的省级水资源管理信息系统，并完成与中央平台的互联互通。天津市率先建立地下水与水环境监测系统，为实时了解地下水采补数据、提高地下水管理水平奠定良好基础。泉州市创建红黄蓝动态分区管理模式，设立全市水资源监控调度中心，自主研发建设水资源动态管理系统，基本实现水资源总量、效率、纳污等重要控制指标可监测、可评价、可考核，有效解决了区域性缺水、水污染和用水效率不高等问题。

M.DNA标准DL 5 000；1.重组质粒pCold-SUMO-Penton双酶切产物

M.DNA Marker DL 5 000；1.Double enzyme digestion products of recombinant plasmid pCold-SUMO-Penton

图2 重组质粒pCold-SUMO-Penton双酶切鉴定结果

Fig.2 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pCold-SUMO-Penton

1.2.4 Penton基因的原核表达 将鉴定正确的重组质粒pCold-SUMO-Penton 转入Rosetta(DE3)感受态细胞，挑选生长良好的菌落，接入LB培养基(含50 μg/mL氨苄青霉素)，取过夜菌液1/50稀释，37℃振荡培养至OD600 nm=0.4～0.6，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，15℃诱导表达18 h，同时设置Rosetta(DE3)(pCold-SUMO空质粒)同步诱导作为阴性对照。诱导完成后，4 000 r/min离心15 min收集诱导表达的细胞，弃上清，加500 μL重悬液。重悬后，冰上超声破碎至菌液清亮。12 000 r/min离心10 min破碎菌体，吸出上清不做处理，沉淀加150 μL重悬液重悬。对收集的上清和沉淀做处理后，SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。

图3 Penton基因的核苷酸序列进化分析

Fig.3 Phylogenetic tree analysis of Penton gene

2.4 Penton基因在大肠埃希菌中的表达及可溶性分析

在终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导下，pCold-SUMO-Penton在Rosetta(DE3)感受态细胞中成功表达(图4)，在75 ku处出现特异条带，通过与对照组比较，可知该融合蛋白主要在上清中表达。

M.蛋白分子质量标准；1.空载体对照；2.未诱导的Rosetta(pCold-SUMO-Penton)对照；3.Rosetta诱导上清(pCold-SUMO-Penton)；4.Rosetta诱导沉淀(pCold-SUMO-Penton)

M.Protein molecular weight Marker；1.Empty vector control；2.Uninduced pCold-SUMO-Penton；3.Induced pCold-SUMO-Penton supernatant；4.Induced pCold-SUMO-Penton sediment

图4 重组蛋白表达产物的SDS-PAGE分析

Fig.4 SDS-PAGE analysis of expressed products of recombinant protein

2.5 表达产物Western blot检测

将诱导后的pCold-SUMO-Penton进行SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜，用抗His标签鼠单克隆抗体检测后(图5)，空载体对照组在75 ku～100 ku处没有表达，而诱导后的重组表达菌中上清和沉淀均有表达，且上清中表达量明显高于沉淀中的表达量。证明pCold-SUMO-Penton融合蛋白成功表达，且该融合蛋白能够与抗His标签鼠单克隆抗体产生特异性反应。

M.蛋白分子质量标准；1.空载体对照；2.Rosetta(pCold-SUMO-Penton)诱导上清；3.Rosetta(pCold-SUMO-Penton)诱导沉淀

M.Protein molecular weight Marker；1.Empty vector control；2.Induced pCold-SUMO-Penton supernatant；3.Induced pCold-SUMO-Penton sediment

图5 重组蛋白与His标签单克隆抗体Western blot检测

Fig.5 Western blot analysis of recombinant protein using His tag monoclonal antibodies

2.6 重组蛋白的表达及纯化结果

pCold-SUMO-Penton诱导后的菌液破菌后，过Ni-NTA洗脱，洗脱样透析SUMO酶切，酶切后再次穿过Ni-NTA去除酶和杂蛋白，穿出的目的蛋白上HiTrap Q1 ml柱，AKTA仪器梯度洗脱(图6)，Penton蛋白用Q柱分离效果好，分离后纯度可达到80%～90%。

M.蛋白分子质量标准；1.SUMO酶酶切前产物；2.SUMO酶酶切后产物；3.Ni柱洗脱后产物；4.HiTrap Q柱对照；5～9.Penton蛋白AKTA仪器梯度洗脱结果

M.Protein molecular weight Marker；1.The products before SUMO enzyme digestion；2.The products after SUMO enzyme digestion；3.The products after Ni column elution；4.HiTrap Q control；5-9.The products of AKTA gradient elution of Penton proteins

图6 重组蛋白纯化后SDS-PAGE分析结果

Fig.6 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant proteins

3 讨论

禽腺病毒Ⅰ亚群目前已鉴定了A～E 5个基因型和12个血清型[12]。Ⅰ群禽腺病毒是鸡内常在性、条件性病原之一，它具有潜在致病力。当鸡群遭遇严重应激，特别是存在免疫抑制性因素的情况下多发，且病情严重，可以引起禽类的多种病症。Ⅰ群禽腺病毒呈世界性分布，所有年龄的家禽以及其他品种的禽类均易感，但是对此尚未进行充分研究[13-14]。目前国内各地区流行的Ⅰ 群禽腺病毒血清型众多。2011年山东省部分地区Ⅰ群禽腺病毒感染，血清2型和血清8型是主要的血清型[15]。2015年在江苏省分离出了Ⅰ群禽腺病毒血清4型新型变异株，且该毒株对雏鸡具有强致病力[16]。近些年来，禽腺病毒感染在国内持续蔓延，各地不断发现新的血清型的Ⅰ 群禽腺病毒对禽类的侵害。

本研究通过对SX17毒株Penton基因的序列分析，发现该毒株Penton全基因与国内近几年流行毒株的核苷酸同源性为99.9%～100%，根据核苷酸序列推导的氨基酸序列同源性则均为100%，通过基因进化树的分析，该毒株与国内近几年流行毒株位于同一分支。确认该毒株属于Ⅰ群禽腺病毒C亚群血清4型毒株，且该毒株与国内的毒株具有密切的亲缘关系，为近几年国内流行毒株的突变株，且证明Penton蛋白具有较好的保守性。

目前国内对于Ⅰ型禽腺病毒的研究多集中于对腺病毒的分离鉴定及生物学特性的研究方面，对于腺病毒蛋白的结构与功能的研究多集中于Hexon蛋白，Penton蛋白作为禽腺病毒的主要结构蛋白，同样具有中和抗原等重要作用，而研究发现抗五邻体抗体可以阻断病毒体从酸性的核内质进入细胞浆，从而使病毒感染性失活[17-18]，所以Penton蛋白的高效原核表达对诊断试剂、抗病毒药物及疫苗的制备研究等都具有重要意义。而目前国内对于Penton蛋白的研究较为薄弱，杨华等[19]对减蛋综合征病毒五邻体基因进行了原核表达，罗思思等[20]对CELO株的五邻体基因进行了原核表达，但其原核表达产物均以包涵体形式存在，而包涵体需要经过变性与复性后才能变成具有一定活性的蛋白，在其提取纯化与变性复性的过程中，操作繁琐、耗时，这些都会对蛋白的活性造成不可控的影响。本研究旨在获取高效表达的可溶性Penton蛋白，通过使用pCold-SUMO表达载体，一种具有冷启动子的表达载体，重组质粒通过低温诱导，可以大大降低蛋白错误折叠的几率，提高蛋白的表达效率[21]。研究过程通过对不同感受态细胞的尝试，以及不同IPTG浓度及诱导时间的摸索，最终获得了溶解性稳定性较好的Penton蛋白。并且本研究中表达的可溶性Penton蛋白挂Ni效果也较好，分离纯化后纯度可达到80%～90%，Western blot检测结果则说明目的蛋白能够被His标签单克隆抗体识别。

本研究利用实验室保存的Ⅰ群禽腺病毒血清4型毒株，对其Penton基因全序列进行扩增并克隆至pCold-SUMO表达载体，成功在大肠埃希菌Rosetta(DE3)感受态细胞中获得了可溶性高效表达，且纯化出的蛋白具有较高的纯度，这为诊断抗原的制备及进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

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