蜜蜂幼虫芽胞杆菌金属蛋白酶基因的原核表达及多克隆抗体的制备

蜜蜂美洲幼虫腐臭病(American foulbrood of honeybees)是由幼虫芽胞杆菌(Paenibacillus larvae)引起的蜜蜂幼虫和蛹的一种急性、毁灭性传染病。该病只感染蜜蜂幼虫[1]，患病蜜蜂幼虫最初会在体色上有明显变化，颜色由正常的珍珠白变为棕黄色、褐色甚至黑褐色，房盖由凸起变为凹陷，且潮湿色暗，感染后期的虫尸可被拉成2 cm～3 cm的细丝，伴有鱼腥臭味，最后紧贴于巢房壁，呈黑褐色难以清除的鳞片状物[2-4]。幼虫芽胞杆菌产生的芽胞有7层结构包围，具有极强的生命力，能抵抗热和化学物质，在高温干燥等恶劣环境下至少能存活35年。该病一旦发生，极易造成蜂群衰弱及蜂群死亡[5-6]。该病最初发生于英国，后来传到欧美各国，现遍布全世界。中国是养蜂大国，也是最大的蜂产品生产和出口国，该病对我国养蜂业的发展以及蜂产品质量已造成严重影响[7]。

幼虫芽胞杆菌主要致病因子是一些胞外分泌的蛋白酶，研究表明，这些蛋白酶为含锌的金属蛋白酶(Paenibacillus larvae metalloproteases，PLMP)，参与幼虫退化[8-11]。Karian A研究发现了完整的幼虫芽胞杆菌金属蛋白酶基因的开放阅读框，并根据该阅读框中完整的基因序列进行了金属蛋白酶重组表达载体的构建，获得了重组蛋白及鼠抗金属蛋白酶基因多克隆抗体[12]。本研究根据幼虫芽胞杆菌PLMP基因序列，设计特异性表达引物，克隆PLMP基因。通过原核表达获得PLMP重组蛋白，并用纯化后的重组蛋白接种家兔，制备兔抗PLMP多克隆抗体，为进一步研究幼虫芽胞杆菌快速检测方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒 幼虫芽胞杆菌，E.coliBL21(DE3)及原核表达质粒pGEX-4T-1，由伊犁出入境检验检疫局保存。

1.2.2 PPG组排除标准 （1）屈光间质中重度浑浊，（2）伴有非青光眼性视神经病变或视网膜疾病，（3）屈光度球镜≥±6D、柱镜≥±2D。

1.1.2 试验用动物 2 kg左右健康雄性新西兰大白兔，购自伊犁职业技术学院。

1.2.3.4 重组蛋白的纯化 采用切胶法纯化。先将样品进行SDS-PAGE电泳，电泳后的凝胶，先用1×PBS反复清洗3次，再用-20℃预冷的0.25 mol/L KCl溶液染色2 min左右，最后用液氮冷冻，充分研磨。用适量PBS混匀粉末，再反复冻融3次，4℃、12 000 r/min离心15 min。吸取上清液即为纯化后重组蛋白。

1.1.4 主要试剂 10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶，均购自TaKaRa公司；DNA胶回收试剂盒，购自Axgen公司；T载体，购自北京全式金生物技术有限公司；DH5α感受态细胞，购自北京鼎国生物技术有限公司；BamHⅠ、EcoRⅠ限制性内切酶，购自New England Biolabs公司；质粒提取试剂盒及T4 DNA连接酶，购自TaKaRa公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，购自Sigma公司；HRP标记的羊抗兔IgG二抗，购自KPL公司；TMB底物溶液，购自康维世纪公司；DAB显色液，购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 PLMP基因扩增 根据GenBank公布的幼虫芽胞杆菌核苷酸序列(CP003355.1)，利用 Primer premier 5.0设计1对特异性引物(见表1)，引物的5′端分别加 BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点识别序列。将幼虫芽胞杆菌阳性菌液DNA作为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系：10×PCR buffer 3 μL，MgCl2 2.5 μL，dNTPs 2.5 μL，Taq 酶(5U)0.25 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，加ddH2O补足至25 μL。反应条件为：95℃ 10 min；93℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃延伸5 min。反应产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测后用DNA胶回收试剂盒回收目的片段。

表1 PCR扩增PLMP基因所需的引物序列

Table 1 The primer sequences used for PLMP gene amplification by PCR

名称Name引物序列Primer sequence酶切位点Rescriction siteMet-F5'-CGCGGATCCAATGAAGAAG-GAGAGAT-3'BamHⅠMet-R5'-CCGGAATTCTTATTTGACTC-CAACGGC-3'EcoRⅠ

1.2.2 原核表达载体pGEX-4T-1-PLMP的构建 PCR产物经胶回收纯化后与T载体连接(25℃ 15 min)，连接产物转化至DH5α感受态细胞中，经液体无抗性LB培养基37℃、200 r/min摇菌复苏。复苏后4 000 r/min离心3 min～5 min，弃上清液，菌泥混匀后均匀涂于Amp+LB平板上，37℃培养过夜。挑取单个菌落，经PCR鉴定为阳性菌落后摇菌培养37℃ 12 h～16 h，提取重组质粒。将重组质粒和pGEX-4T-1分别用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切，酶切产物经胶回收后用T4连接酶16℃连接过夜，将连接产物转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，按上述复苏方法复苏后均匀涂板于Amp+LB平板上，挑取单个菌落，经PCR鉴定为阳性菌落后，37℃、200 r/min摇菌培养过夜。菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，分析测序结果。

1.2.3 PLMP重组蛋白的诱导表达及条件优化、纯化1.2.3.1 最佳诱导浓度的确定 将300 μL重组菌pGEX-4T-1-PLMP接种至Amp+LB液体培养基中，37℃、200 r/min，摇菌条件下培养至OD600 nm值达到0.4～0.6之间，分别加入终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG。在37℃、200 r/min摇菌诱导8 h，经重组蛋白SDS-PAGE检测，确定最佳诱导浓度。

1.2.3.2 最佳诱导时间的确定 将300 μL重组菌pGEX-4T-1-PLMP接种至30 mL的Amp+LB液体培养基中，37℃、200 r/min振摇条件下培养至OD600nm值达到0.6左右，加入0.8 mmol/L IPTG，分别诱导1、2、3、4、5、6、7、8 h。经重组蛋白SDS-PAGE检测，确定最佳诱导时间。

分析两届规则，在难度的评价方式上有较为明显的差异，主要从以下几方面体现:十四届采用的规则中明确要求每个难度级别的成套动作编排必须达到规定数量的难度且必须含有各种类别难度，否则要扣除难度分，每个难度动作都用相应的分值，最后获得的难度得分为完成难度分值的总和[1]；而十五届采用的新规则中对难度动作类别、难度动作数量均无具体的要求，只是在评分表中明确了各类难度所占的分值，每个难度动作没有固定分值，最后难度得分依据各类难度整体的表现分别获得评分。

1.1.3 主要仪器设备 PCR仪，电泳仪，紫外分光光度计，凝胶成像仪，温箱，冰箱，离心机，微量振荡器，微量移液器，金属干浴锅，超声波破碎仪，恒温摇床，半干转印槽，全功能微孔板检测仪。

1.2.3.5 重组蛋白的定量 按照BSA试剂盒对纯化后的蛋白进行定量。将BSA试剂盒中的标准样品，根据说明书方法，分别稀释到2 000、1 500、1 000、750、500、250、100 μg/mL。将纯化后的蛋白与上述不同浓度的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，重组蛋白的条带与标准样品条带比对后即可得出重组蛋白含量，或用紫外分光光度计检测纯化后的蛋白浓度。

交互多模型算法(IMM)是由Blom和Bar-Shalom提出的一种软切换算法，应用很广泛。近年来IMM研究的主要内容第一层是变结构交互多模及模型集自适应、转移概率自适应，而第二层是目标运动模型、非线性滤波器及其参数自适应。虽然IMM的机理从理论上仍然无法论证清晰，但交互多模型混合估计方法仍然成为机动目标跟踪领域主流的混合估计方案。

SEN反映了算法识别跌倒数据的能力。在实际使用中,我们不希望漏报任何一次跌倒,因此算法的SEN显得尤为重要。在表2中,MobiAct数据集上的SEN均低于SisFall数据集,这主要是MobiAct数据集中跌倒与非跌倒样本比例不均衡导致的。这也提醒我们在实际应用中,应尽量保证训练数据集正负样本比例的均衡。

1.2.5 PLMP多克隆抗体效价的测定 用间接ELISA方法测定。用包被液稀释PLMP重组蛋白至4 μg/mL，以100 μL/孔加入至酶标板，设3个重复，4℃包被过夜。弃液，除净残液，每孔加入150 μL PBST洗液振荡洗板3次，20 s/次，弃液拍干。每孔加入200 μL 50 g/L脱脂乳粉，37℃封闭1 h，用PBST洗板3次同上。用50 g/L脱脂乳稀释待检血清，稀释8个梯度，稀释度分别为1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600。每个稀释度酶标板上每孔加入100 μL，同时设置阴性对照(免疫前血清)及空白对照，37℃温育1 h，用PBST洗板3次同上。用PBST 1∶5 000倍稀释HRP-山羊抗兔IgG，每孔加入100 μL，37℃温育1 h，用PBST洗板3次同上。每孔加入100 μL的TMB显色液，37℃避光显色10 min后，每孔加入50 μL的终止液终止显色，在酶标仪上读取OD450nm值。效价判定：待检血清(P)OD450/阴性血清(N)OD450>2.1，待检血清最大稀释倍数即为多抗效价。

1.2.6 PlMP多克隆抗体反应性的检测 用Western blot方法检测。蛋白经SDS-PAGE电泳，保留分离胶，剪取大小合适的NC膜；将PAGE胶、NC膜和两片滤纸分开浸泡在转印液中20 min；打开半干转印槽，将滤纸-NC膜-凝胶-滤纸按从下到上顺序放入转印槽中央，轻赶气泡，以15 V电压，转印45 min；取出NC膜，用PBST洗液洗3次，将NC膜置于50 g/L脱脂乳溶液中，4℃封闭过夜，PBST溶液40 r/min振荡洗涤3次，每次6 min～8 min。用50 g/L脱脂乳1∶1 000稀释兔抗PLMP多抗血清，将NC膜放入其中，37℃温育NC膜 1 h，PBST振荡洗膜3次。用PBST 1∶10 000稀释HRP-山羊抗兔IgG，将NC膜放入其中，37℃温育NC膜1 h，PBST振荡洗膜3次。将NC膜置于现配的DAB显色液中，出现目的条带后，用蒸馏水终止显色，拍照保存显色结果。

2 结果

2.1 PLMP基因的扩增和原核表达载体pGEX-4T-1-PLMP的构建

用间接ELISA测定抗幼虫芽胞杆菌PLMP多克隆抗体效价为1∶12 800(图8)。

1.2.3.3 重组蛋白SDS-PAGE的检测 经上述不同条件下诱导的pGEX-4T-1-PLMP重组菌液，经4℃、4 000 r/min离心10 min，收集菌体沉淀，用2 mL 1×PBS(pH7.4)混匀菌体沉淀，经4℃、10 000 r/min离心10 min，吸弃上清液。重复该过程3次。在菌体沉淀中加入2 mL的PBS，置于冰上，超声破碎8 min(超5 s停8 s)，4℃、1 000 r/min离心5 min。分离上清液与沉淀，沉淀用1 mL PBS重悬。分别取上清液与沉淀悬液各50 μL，加入等体积的2×SDS-PAGE，置沸水中10 min后经10 000 r/min离心5 min。将上述煮沸处理好的上清液及沉淀悬液样品，分别加样至SDS-PAGE凝胶中，80 V电泳45 min左右，再改为120 V电泳40 min。电泳后的凝胶，用考马斯亮蓝染色液染色10 min，再脱色。

M.DNA标准DL 2 000；1.PLMP基因 PCR产物 M.DNA Marker DL 2 000；1.PCR products of PLMP gene

图1 PLMP基因PCR鉴定结果

Fig.1 Identification of PLMP gene by PCR

M.DNA标准DL 5 000；1.pGEX-4T-1-PLMP质粒双酶切产物;2.pGEX-4T-1质粒

M.DNA Marker DL 5 000；1.pGEX-4T-1-PLMP digested by BamHI and EcoRI;2.pGEX-4T-1plasmid

图2 pGEX-4T-1-PLMP双酶切鉴定结果

Fig.2 Identification of pGEX-4T-1-PLMP by enzyme digestion

2.2 重组PLMP蛋白诱导表达条件的优化、纯化及定量

重组蛋白经SDS-PAGE鉴定，获得分子质量大小约为70 ku的重组蛋白，与预期大小相同，表明幼虫芽胞杆菌PLMP重组蛋白正确表达。根据SDS-PAGE条带大小，确定IPTG终浓度为0.8 mmol/L时诱导表达的量最大且重组蛋白存于菌液沉淀中(图4)。重组蛋白诱导表达5 h时表达的量最大，结果见图5所示。在最佳条件下诱导出的PLMP重组蛋白，经SDS-PAGE切胶法纯化，用BSA标准样品SDS-PAGE法及紫外分光光度计法测定纯化蛋白浓度均为1.0 mg/mL(图6和图7)。

1.2.4 PLMP多克隆抗体的制备 取2 mg纯化的PLMP蛋白(1 mg/mL)与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，将乳化好的混合液对新西兰兔背部皮下多点注射免疫。首免后15 d，取1 mg纯化的PLMP蛋白(1 mg/mL)与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化，将乳化好的混合液对兔进行加强免疫。此后每隔7 d用同量的乳化液对兔再免疫，共3次；最后一次免疫7 d后，颈动脉采血，将血液37 ℃温育2 h后4 ℃静置过夜，然后4 000 r/min离心10 min，收集血清并分装，于-20℃保存。

2.3 PLMP多克隆抗体效价的测定

以蜜蜂幼虫芽胞杆菌菌液为模板，利用合成的特异性引物，PCR扩增目的基因，获得与预期条带大小一致约1 200 bp的核苷酸序列，见图1所示。重组原核表达载体pGEX-4T-1-PlMP菌液鉴定及双酶切鉴定均获得大小约为1 200 bp的扩增片段(图2和图3)。重组阳性菌液送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序鉴定，测序结果与GenBank(CP003355.1)公布的序列同源性达99%。说明已成功构建pGEX-4T-1-PLMP基因原核表达载体。

M.DNA标准DL 2 000；1.阴性对照；2.pGEX-4T-1-PLMP PCR产物

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control;2.PCR products of pGEX-4T-1-PLMP

图3 pGEX-4T-1-PLMP PCR鉴定结果

Fig.3 Identification of pGEX-4T-1-PLMP by PCR

M.蛋白分子质量标准；1.pGEX-4T-1-PLMP转化菌未诱导的上清液；2～6.37℃下pGEX-4T-1-PLMP转化菌IPTG终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的上清液；7.pGEX-4T-1-PLMP转化菌未诱导的沉淀；8～12.37℃下pGEX-4T-1-PLMP转化菌IPTG终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的沉淀

M.Portein molecular weight Marker;1.The supernatant of non-inducted pGEX-4T-1-PLMP;2-6.The supernatants of inducted pGEX-4T-1-PLMP with 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L IPTG for 8 h at 37℃;7.The precipitate of non-inducted pGEX-4T-1-PLMP; 8-12.The precipitates of inducted pGEX-4T-1-PLMP with 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/LIPTG for 8 h at 37℃

图4 不同浓度IPTG对幼虫芽胞杆菌PLMP重组蛋白诱导表达的影响

Fig.4 Effects of different IPTG concentrations on expression of Paenibacillus larvae PLMP recombinant proteins

M.蛋白分子质量标准；1～9.37℃下0.8 mmol/LIPTG诱导pGEX-4T-1-PLMP时间为0、1、2、3、4、5、6、7、8 h

M.Portein molecular weight Marker;1-9.Inducted pGEX-4T-1-PLMP with 0.8 mmol/L IPTG at 37℃ for 0，1，2，3，4，5，6，7，8 h

图5 诱导时间对幼虫芽胞杆菌PLMP重组蛋白诱导表达的影响

Fig.5 Effects of induction time on expression of Paenibacilluslarvae PLMP recombinant proteins

M.蛋白分子质量标准；1～7.BSA标准样品浓度为2 000、1 500、1 000、750、500、250、100 μg/mL；8.纯化后的PLMP重组蛋白

以PLMP重组蛋白为抗原，以1∶1 000稀释兔抗血清为一抗，Western blot检测抗原与抗体特异性结合，DAB显色后出现条带(图9)。

图6 PLMP重组蛋白的纯化及定量

Fig.6 Purification and quantification of PLMP recombinant protein

2.4 PLMP多克隆抗体反应性的测定

M Portein molecular weight Marker;1-7.The concentrations of BSA standard with 2 000,1 500,1 000,750,500,250,100 μg/mL;8.The purified PLMP recombinant protein

3 讨论

目前，针对蜜蜂幼虫芽胞杆菌的检测多采用PCR检测技术。Govan V A等[13]根据幼虫芽胞杆菌16SrRNA编码基因片段设计的引物特异性较强。此后设计的1对引物KAT1和KAT2，该引物特异性强并且可以鉴别出幼虫芽胞杆菌的不同亚种[14]。通过对这些PCR技术的改进及引物的改良，何晓杰等[15]建立的二温式PCR方法将退火和延伸温度合二为一，结果显示其检测幼虫芽胞杆菌的DNA灵敏度达33 fg/μL，且重复性良好。虽然PCR检测方法特异性强，灵敏度较高，但是需要特殊仪器设备，对实验操作条件较严格，并不利于基层及现场快速检测，所以建立对幼虫芽胞快速检测的方法显得十分必要。

作为新时代背景下的技术革新，物联网技术的发展与应为为社会各个领域提供了崭新的发展契机。铁路运输作为我国运输体系的重要组成部分，货运业务的安全与效率提升一直以来都是影响社会发展的重要因素。铁路运输与物联网技术的融合过程中，摒弃了传统管理方式的一些不足，实现了新时代背景下管理方式的优化与创新。

图7 紫外分光光度计测定纯化后的PLMP重组蛋白浓度

Fig.7 Determination of the purified PLMP recombinant proteins by UV spectrophotometer

图8 抗幼虫芽胞杆菌PLMP多克隆抗体血清效价

Fig.8 Titers of polyclonal antibodies against Paenibacilluslarvae PLMP

M.蛋白分子质量标准；1.幼虫芽胞杆菌PLMP重组蛋白；2.阴性对照

M.Portein molecular weight Marker;1.Recombinant protein of Paenibacillus larvae PLMP 2.Negative control

图9 抗幼虫芽胞杆菌PLMP多克隆抗体反应性

Fig.9 Reactivity of polyclonal antibodies against Paenibacilluslarvae PLMP

本研究根据一段完整的基因序列，利用原核表达质粒pGEX-4T-1在E.coliBL21(DE3)感受态中成功表达了幼虫芽胞杆菌金属蛋白酶PLMP基因蛋白，对pGEX-4T-1-PLMP重组蛋白进行表达形式分析，结果显示重组蛋白存在于重组菌液沉淀中，其分子质量大小约为70 ku。

已是深夜，雅罗斯夫才回到家里。“你又到哪儿闲逛去了？”妻子大声训斥着拧开灯，“为了等你回来，我在床上看报纸看到晚上3点。”

试验证明，变性的蛋白质抗原只要具备一级结构，免疫动物后也可产生抗体[16]。本研究对制备的PLMP重组蛋白采用切胶法纯化，该纯化方法能够较好地提高重组蛋白的免疫纯度和免疫效果[17]。将纯化的PLMP重组蛋白与弗氏佐剂混合后免疫家兔，成功获得兔抗PLMP多克隆抗体，经间接ELISA检测，多抗效价较高，经Western Blot方法测定，该多抗具有较好的反应性。

高效价的抗体是研究建立免疫学检测方法的基础条件之一。多克隆抗体由于制备简单，且能与多个抗原表位结合，在免疫学上应用广泛[18-19]。本研究所制备的多克隆抗体具有较好的反应性，这为建立检测PLMP蛋白的双抗夹心ELISA方法提供了条件，本研究制备的PLMP重组蛋白和高效价多抗也为幼虫芽胞杆菌胶体金快速检测试纸条方法的建立奠定了基础，PLMP重组蛋白为制备PLMP单克隆抗体提供了较好的抗原。

通常意义上，因为快速发展的技术和全新的发展模式等多个因素的综合作用，我国的诸多企业在新时期的发展过程中都不断朝着科学化和专业化的方向发展，而随着全世界的智能化水平的提升与完善，企业在发展过程中也开始更加关注智能化，这对于我国的电力行业的现实发展来说具有重要的意义，在极大程度上促进了我国智能变电站系统的整体发展趋于稳定化。与此同时，应用智能变电站顺控操作逻辑编制也在较大程度上促进了整个智能变电站系统的完善和正常运行环节都提升了效率，并有效地降低了企业的人力资源成本，促进相关的企业能够在竞争压力巨大的环境中实现更加顺利的发展。

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