B6-Co突变系小鼠眼睑组织差异表达蛋白筛选

角膜病是临床眼科中一类高发率的复杂性、难治性眼部疾病，而角膜病中尤以角膜混浊最为常见，是全球视力损伤的主要原因之一，也是我国主要的致盲眼病之一。B6-Co突变系小鼠是由南通大学实验动物中心自主培育的具有角膜混浊表型的小鼠，是研究人类角膜病的良好动物模型。该小鼠出生时眼睑开放，通常被称之为EOB(eye open at birth)表型。出生后眼睑逐步产生角膜炎，进一步发展为角膜混浊，其病理变化过程与人类角膜混浊的病理变化过程极为相似[1]。蒋荧梅等通过长期观察发现眼睑开放与角膜混浊成对应关系[2]。但该品系小鼠EOB表型产生的遗传机制至今未能阐明，本文拟采用双向凝胶电泳结合质谱技术的方法，对C57BL/6小鼠及B6-Co小鼠眼睑组织胚胎发育期间差异表达蛋白进行筛选并比较分析，以期能够发现B6-Co小鼠胚胎期眼睑组织的差异表达蛋白，为进一步研究该突变系小鼠眼睑发育缺陷的发生机制提供新的思路，从而为深入研究人类遗传性角膜病的发生发展机制提供有益借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 B6及B6-Co小鼠由南通大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证为SCXK(苏)2014-0001，实验动物使用许可证为SYXK(苏)2015-0016。小鼠均饲养于清洁级屏障环境内，室内湿度控制在55%±5%范围内，温度控制在23℃±2℃，饲料由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，并经60Co辐照照射，室内照明12 h∶12 h明暗交替，每周更换一次笼具、垫料。将B6-Co小鼠与B6小鼠以1∶2的比例在晚9点合笼交配，次日上午8：00之前检栓，并将检到阴道栓的小鼠分笼饲养。检到栓的雌鼠记为孕0.5 d，取E16.5 d小鼠眼睑组织进行实验。

1.1.2 试剂 丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、尿素、硫脲、十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)，碘乙酰胺(IAM)、CHAPS、蛋白酶抑制剂(PMSF)、线性固相pH 3-10梯度预制胶条、低熔点琼脂糖、R250考马斯亮蓝、矿物油，其他常用试剂为国产分析纯市售商品。实验用水均为Milli-Q去离子水。

方法的选择应遵循所选教材的特点和学习认知活动过程中的任务要求，考虑教师驾驭各种教学方法的能力及教学方法对学生学习认知活动开展的辅助效能等。

式中,Ppri为弹体销蚀侵彻的侵彻深度;Pdef,r为残余弹体在变形非销蚀状态下的侵彻深度;Prig,r为 弹体刚体状态下的侵彻深度。Ppri可以通过将式(7)中的vid替换成vh得到：

1.2 方法

对B6与B6-Co小鼠眼睑组织表达有明显变化的29个蛋白点进行质谱鉴定，共成功鉴定出24个蛋白。表达上调的7个蛋白点中成功鉴定出6个蛋白，质谱鉴定结果情况见表1。其中包括肌动蛋白(Put.beta-actin)、钙网蛋白(calreticulin)、抗氧化还原酶(Prdx2)、膜联蛋白(annexin A5、annexin A2)和载脂蛋白(apolipoprotein A-I)。

1.2.2 蛋白样品制备及定量 剖取E16.5 d胎鼠，在体式显微镜下用眼科剪刀和眼科镊子取胎鼠眼睑组织，用PBS清洗组织上血渍。每1 mg眼睑组织加入1 000 μL蛋白裂解液，冰上孵育5 min，冰上研磨至无明显组织块。12 000 r/min、4℃离心40 min，取上清，RC DC法测定蛋白浓度后，分装成小管于-80℃冰箱保存备用。

1.2.3 双向凝胶电泳 参照BIO-RAD公司双向电泳实验指南的方法进行。将1 mg蛋白和上样缓冲液混合，总体积为350 μL，用pH 3～10,17 cm IPG预制胶条总聚焦55 000 Vh，水化、聚焦均在17℃下进行，完成双向电泳第一向。平衡液A/B分别平衡15 min。结束后用100 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳作为分离胶进行双向电泳的第二向。用R250考马斯亮蓝进行染色。

1．2 实验方法和程序 给全体被试在一安静房间内依次施测区分愿望任务、区分信念任务、意外内容、意外地点任务。区分愿望任务测试了儿童对愿望的理解，总分1分；区分信念任务测试儿童是否能区分自己和他人的信念，总分1分；后两个任务则测试了儿童对错误信念的理解，总分3分。所有的任务均用实物模型演示。

本研究通过蛋白质组学技术筛选与B6-Co小鼠出现EOB表型相关的蛋白。应用双向凝胶电泳技术在B6-Co中分离出了759±28个蛋白点，B6组中分离出了796±37个蛋白点。通过图像分析软件，进行比较分析，共筛选出表达具有显著差异的蛋白点29个，其中表达上调的有7个，表达下调的有24个。我们在29个蛋白点对应到凝胶上，进行手工切取，装入EP管中送往生物公司进行质谱鉴定，成功获得了24个蛋白点的信息。这些蛋白主要在内质网、细胞骨架、中间丝等重要的细胞结构中发挥各自的生物学功能。

2 结果

2.1 双向电泳图谱获得及图像分析

B6与B6-Co小鼠眼睑组织蛋白根据等电点的不同进行分离，然后按照相对分子质量的大小进行第二向凝胶电泳进行分离，获得的双向电泳图谱经PD-quest v8.0.1软件分析，经比较得到表达有明显变化的蛋白点，在B6-Co小鼠眼睑组织中有7个蛋白点显著上调(图1)，22个蛋白点显著下调(图2)。

图1 B6-Co眼睑组织蛋白双向电泳表达图谱

Fig.1 The 2-DE diagram of eyelid tissue protein of B6-Co

2.2 差异蛋白点的质谱鉴定

1.2.1 试剂配制 蛋白裂解液、水化上样缓冲液、胶条平衡缓冲液(A/B)、电泳缓冲液、100 g/L聚丙烯酰胺凝胶、5 g/L低熔点琼脂糖封胶液、考染固定液、洗脱液等，由本实验室配制。

角蛋白是角质形成细胞的细胞骨架的主要成分，属于纤维性的蛋白质，广泛存在于上皮细胞中，有维持细胞形态完整性、应激反应和代谢等多重功能，也参与多种细胞生命活动[5]。已有很多研究证实角蛋白与多种皮肤疾病相关[6]。本次研究发现角蛋白1(keratin 1，KRT1)、角蛋白19(keratin 19，KRT19)表达量较B6小鼠出现显著下调。吴刘成等研究发现，由于角质形成细胞细胞骨架异常使得B6-Co小鼠在胚胎眼睑闭合的关键时期角质形成细胞出现迁移障碍，导致眼睑闭合不全[7]。我们认为KRT1和KRT19的表达量下降与B6-Co小鼠眼睑角质形成细胞骨架的异常相关，从而影响小鼠眼睑发育。

1.2.4 凝胶图谱分析 单反相机获取图像，用Bio-Rad PD-quest v8.0.1软件对图像进行分析，找出表达量存在差异的蛋白点。

图2 B6眼睑组织蛋白双向电泳表达图谱

Fig.2 The 2-DE diagram of eyelid tissue protein of B6

3 讨论

HSP70是热休克蛋白家族中存在最广泛、研究最多的一员，具有抑制细胞凋亡及抗炎抗氧化的作用[8]。在B6-Co小鼠眼睑组织中显著下调，有可能影响小鼠的免疫力，增加其感染病菌的风险；也有实验证实干扰HSP70可降低肿瘤细胞的迁移能力[9]，通过siRNA干扰HSP70可以抑制A549细胞的增殖，并对其凋亡有促进作用[10]。细胞迁移对眼睑的发育十分重要，小鼠的眼睑从开始形成至完成上下眼睑的融合，涉及到细胞增殖、迁移与分化，但前期的研究证实该突变系小鼠在胚胎期眼睑闭合不全主要是由角质形成细胞迁移能力的下降所引起的。热休克蛋白的表达下调可能也影响了角质形成细胞的迁移。我们后期实验的研究将通过分离眼睑组织中不同种细胞分别进行培养，利用siRNA干扰HSP70检测其是否影响细胞的增殖或迁移，如若影响，又是影响何种细胞的何种功能。

1.2.5 质谱鉴定 将凝胶上的差异蛋白点手工割取，送往中科新生命生物科技公司进行质谱鉴定。

表1 表达上调蛋白点质谱鉴定结果

Table 1 The identification results of up-regulated proteins

编号Spot №蛋白名称Protein nameNCBI 编号Accession №分子质量/kuMW等电点PI1肌动蛋白 Put.beta-actin gi|4986839445.85.782钙网蛋白 Calreticulingi|1309743248135.94.32993过氧化物酶2 Prdx2gi|5198069921936.15.19994膜连蛋白A5 Annexin A5gi|14870312635787.24.835载脂蛋白A-I Apolipoprotein A-Igi|14869373128516.65.636膜连蛋白A2 Annexin A2gi|14869422638936.97.55

表2 表达下调蛋白点质谱鉴定结果

Table 2 The identification results of down-regulated proteins

编号Spot №蛋白名称Protein nameNCBI 编号Accession №分子质量/kuMW等电点PI1核糖体蛋白 Ribosomal proteingi|14868614011643.84.422未命名蛋白 Unnamed protein productgi|7420006942340.64.573层黏连蛋白受体 Laminin receptorgi|17194878232943.54.84热休克蛋白70 HSP70 gi|1283584572492.55.015组蛋白 H2bbgi|10973371113943.610.316热休克蛋白27 HSP27gi|42414322943.76.457组蛋白 H2bcgi|1804386513897.610.318磷蛋白 Pr22gi|124680517263.95.769未命名蛋白 Unnamed protein productgi|2635379457102.85.7810高迁移率族蛋白 HMG-1gi|43710225049.25.619911烯醇酶 Enolase 1gi|13377712147453.36.369912磷酸丙糖异构酶 TPIgi|328737427037.96.913膜联蛋白1 Annexin1gi|7091232138995.17.5914链相关蛋白A Chain Agi|45935881238936.97.5515角蛋白1 Keratin 1gi|14867207466078.58.3916mCG121511gi|14870864318130.97.7417丝切蛋白1 Cofilin 1gi|6287176118775.88.2218角蛋白19 Keratin 19gi|5515393744514.75.28

表达下调的22个蛋白点中成功鉴定出18个蛋白，质谱鉴定结果见表2。包括核糖体蛋白(ribosomal protein)、层黏连蛋白受体(laminin receptor)、热休克蛋白(HSP70、HSP27)、组蛋白(H2bb、H2bc)、磷蛋白(Pr22)、高迁移率族蛋白(HMG-1)、烯醇酶(enolase 1)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、膜联蛋白(anxa1)、链相关蛋白A(chain A)、角蛋白(keratin 1、keratin 19)、丝切蛋白(cofilin 1)、mCG121511以及两种未知蛋白。

胚胎期的眼睑发育是一个复杂的动态生命过程。小鼠在正常发育过程中，胚胎第11天开始出现眼睑，随着眼睑不断生长发育在胚胎第16.5天完成整个角膜的覆盖，眼睑上、下缘融合，即出生时眼睑闭合，出生后14 d眼睑重新开放[3]。许多调控眼睑发育的信号通路出现异常会引起胚胎期眼睑闭合不全，而这种胚胎期上下眼睑融合失败，属于先天性眼部缺陷，可引起较为严重的眼部疾病[4]。因此，借助B6-Co小鼠模型结合差异蛋白质组学技术的应用来筛选导致眼睑发育异常的关键蛋白，对人类该种先天性眼部疾病的早期诊断、预防和治疗具有极其重要的理论意义和应用价值。

载脂蛋白目前最受关注的是其在心血管疾病严重程度判断的重要指示作用[11]。同时，它还具有抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化等作用[12]。结合本课题组前期试验结果分析B6-Co小鼠可能存在代谢方面的改变，B6-Co小鼠由于出生时眼睑开放，使其逐步发展为角膜炎。热休克蛋白表达量的减少提示B6-Co小鼠可能在免疫功能方面存在缺陷，可能使得具有抗炎作用的Apoa1为增强其抗炎能力而出现表达量显著上调的现象。

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综上所述，本试验通过B6与B6-Co小鼠眼睑组织的蛋白质双向电泳的差异分析，同时结合质谱鉴定，成功鉴定出24个表达存在明显差异的蛋白，其中包括2个未知蛋白。对已知的蛋白进行分子功能分析并综合前期研究结果和文献报道，发现其中值得关注以及深入研究的有角蛋白、热休克蛋白以及载脂蛋白，这些蛋白可能在眼睑发育过程中发挥重要的作用。

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