高原鼢鼠微卫星多态位点筛选及其通用性检测

微卫星(Microsatellite)DNA，是以2～6个碱基序列为核心单位，串联排列的核苷酸序列，广泛存在真核生物的基因组中[1]。由于操作难度低，包含信息丰富，在相关领域被学者们作为首选标记，广泛运用。尤其在物种分化、遗传多样性、遗传结构和资源保护利用管理中运用很广[2-3]。由于微卫星引物的设计位置处在重复序列两端的侧翼序列，因此，相较于其他各种遗传标记的方法，进行微卫星标记时，获得其位点的序列信息是前提[4]。之后的首要步骤，就是对微卫星标记进行筛选。针对微卫星位点的发掘，方式众多，随着科技发展，最早的分离法已较少运用，各种富集法渐渐出现，使操作变繁为简，大大增加工作效率[4]。跨种扩增及其通用性检测是利用微卫星位点在亲缘关系较近的物种中具有保守性的特点，在其他物种信息的基础上，快速、高效的一种方法，已在部分研究中显示出了极大价值[5-7]。

高原鼢鼠(Eospalax baileyi)隶属啮齿目(Rodentia)，鼹形鼠科(Spalacidae)，鼢鼠亚科(Myospalactinae)，凸颅鼢鼠属(Eospalax)[8-9]，是分布于青藏高原的特有物种，为高寒草地生态系统中的固有成员，正常情况下，对草地适度的啃食对其生态系统有利，对整个草地生态环境起到了不可替代的重要作用[10]，作为草地生物多样性的组成部分之一，其在草地生态系统具有特殊的地位，对于能量流通和物质循环有重要作用[11-12]，享有“生态系统工程师”的美誉[13]。随着人类活动的影响，草地退化越来越严重，致使水土流失，生物多样性越来越少，生态安全面临严峻的形势[14]，也使得草地管理利用问题更加突出[15]。高原鼢鼠物种演化历史漫长，生活方式特殊，生态作用重要，因此相关领域的学者对高原鼢鼠产生了浓厚兴趣[16-17]。然而，高原鼢鼠特有的地下生活方式，加之趋同、平行进化等影响，使得有关该物种的分类、生态等相关知识不足，亟需利用现代生物学技术进行补充佐证。高原鼢鼠多态性微卫星位点的获得对开展有关高原鼢鼠的行为生态学、分子生态学和种群遗传学相关研究，弥补传统生态学研究具有重要的意义。通过提取不同地区高原鼢鼠种群DNA，候选鼹形鼠科(Spalacidae)和近缘种甘肃鼢鼠(Eospalax cansus)的微卫星位点，在高原鼢鼠中进行PCR扩增及其多态性检测，旨在为高原鼢鼠的分子遗传生态方面的研究和高原鼢鼠高效科学的管理提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物

试验动物于2015年3～7月，采集于甘肃省省内现有分布地天祝、玛曲、碌曲等。麻醉，血液采集完毕后并处死，同时解剖，取出肝脏组织，完成之后，用浓度为95%的乙醇保存，并将冰箱冷冻室温度调节至-70℃，将组织样本放入保存。参考类似研究[8]，和标本一一对照，根据特征进行物种的鉴定。

解析： 贯穿整题的切入点则是判断性状的显隐性及判断基因在常或性染色体上，难度较大。以学生熟知的果蝇这一经典实验材料，设置新的科学故事，结合果蝇染色体的组成，通过数据表格给出解题线索。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取与检测 取0.3 g 新鲜的鼢鼠肝脏组织，按照常规的酚/氯仿抽提基因组DNA[18]。取2 μL总DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测基因组。

1.2.2 SSR 引物的筛选及扩增 从同科的鼹鼠(Spalax ehrenbergi)的27对[19]，和同属的甘肃鼢鼠的引物中选取60对，共87对[20]，上海生工生物工程技术服务有限公司完成合成工作。采用高原鼢鼠混合DNA 池作为模板来进行微卫星引物的摸索条件和扩增梯度工作，将引物的最优复性温度和可用于高原鼢鼠的微卫星分析引物进行确定。

微卫星特性突出，被广泛认可，使用其作为群体遗传学研究的标记，效果显著[25]，而从近缘种已有的微卫星标记中筛选被研究物种的标记，被认为是一种快速而有效的方法[6]。通过对鼹鼠、甘肃鼢鼠已有的微卫星标记引物进行筛选，选出鼹鼠的27对微卫星引物，甘肃鼢鼠的60对微卫星引物，并对87对引物进行PCR扩增，其PCR成功扩增了54对，其中鼹鼠的微卫星引物扩增率较低，仅有17对具有稳定的条带，但其中有部分位点条带多，不易区分，全表现为单态。甘肃鼢鼠中有43对扩增成功，多态位点丰富。这一引物通用性情况低于其他近缘种微卫星标记的平均通用性，相比而言，属于正常波动的范围[25]。尽管有类似研究表明,运用一种微卫星引物即可扩增同一属、科、目下的不同物种，但此次研究中与鼹鼠的通用性较差，显示了物种之间的差别。而在同属的甘肃鼢鼠中通用性很好，也进一步说明了亲缘关系对跨种应用的影响。孙波等[26]对社鼠(Niviventer confucianus)近缘物种大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)中已知的70个微卫星位点引物进行跨种扩增，筛选到13个适合社鼠相关研究的多态微卫星引物。但研究未在同科的物种中检测到通用性，这可能和物种的生物学特性有关，笔者研究的物种是地下特有的类群，地下的生物在遗传变异方面有别于其他物种。

病菌的冬孢子散落在土壤中，混入粪肥里或沾在种子表面越冬。冬孢子可在土壤中存活三年左右，玉米播种发芽时，冬孢子同时萌发侵入玉米。从种子萌发至5叶期，都可侵染。病菌侵入后，蔓延在生长锥基部的分生组织中，花芽分化时菌丝向上蔓延至花蕾原始体，形成丝黑穗。

2 结果与分析

2.1 微卫星引物的筛选与扩增

采用之前所筛选的9个具有多态性的微卫星位点，开始50个高原鼢鼠的基因组DNA 的PCR 扩增及电泳检测。等位基因数、观测杂合度、期望杂合度等数据在Popgene 1.32软件和Microsatellite toolkit中进行分析、统计(表1)。等位基因数在4～12，有效等位基因数平均为3.505，除EBGA26位点外，其余位点均处于哈代温伯格平衡状态(表1)。

图1 部分位点的电泳图谱 Fig.1 Electrophoresis patterns of some loci in Eospalax baileyi 注：图中1～7分别是不同的微卫星位点

2.2 微卫星扩增图谱的分析

目前，微卫星标记的筛选方式很多，以通过构建特定大小片段的基因组文库或微卫星富集文库进行筛选、从已经公布的序列中筛查微卫星标记和利用近缘种之间引物的通用性得到目的物种的微卫星标记等[24]。一般而言，微卫星的通用性及扩增出的多态性位点比例随着遗传距离的增加呈减少的趋势。此次试验中，鼹鼠和甘肃鼢鼠的微卫星标记在其遗传距离较远的亲缘种高原鼢鼠当中，能够进行扩增的微卫星位点及等位基因数相对较少。对于高原鼢鼠，现有的基因组信息不足，还没有进行近缘种基因组测序。此次试验依据鼹型鼠科的物种进行了尝试，但跨科扩增的多态性很低。

图2 位点EBGA16的电泳效果 Fig.2 Electrophoresis photograph of EBGA16 注：图中1～22分别是高原鼢鼠种群不同的个体，下同

图3 位点ECT110的电泳效果 Fig.3 Electrophoresis photograph of ECT110

2.3 多态信息含量、遗传杂合度及Hardy-Weinberg 检验

筛选了鼹鼠的27对微卫星引物，甘肃鼢鼠的60对微卫星引物，以随机混合的基因组DNA池为模板进行筛选。经过优化反应条件，87对引物中，PCR成功扩增了54对，其中鼹鼠的微卫星引物扩增率较低，仅有17对具有稳定的条带，但其中有部分位点条带多，不易区分，全表现为单态。甘肃鼢鼠中有43对扩增成功，但只有9对引物的扩增片段有较稳定的多态性，其余都表现为单态，部分扩增结果见图1和表1。

3 讨论

3.1 引物通用性分析

PCR 反应体系总体积25 μL，其组成为10×PCRbuffer 2.5 μL，10 mmol/L 4×dNTPs 0.5 μL，10 pmol/μL上下游引物各1 μL，Taq DNA 聚合酶1 U，50 ng/μL DNA 模板1 μL。反应条件为94℃预变性4 min，94℃变性45 s，适宜的温度退火30 s，72℃延伸30 s，循环30 次，72℃继续延伸5 min，4℃保存。

1.2.3 扩增产物的PAGE检测及统计分析 电泳步骤与方法： 制胶(8.25 mL 30%贮液，11.75蒸馏水，5 mL的5×TBE，0.2 mL)、倒胶、点样、进行电泳、染色(先固定在染色最后显色)、制膜保存，最后观察分析。电泳程序为首先50W预电泳30 min，点样后50 W电泳4～5 h[21]。待胶板自然干燥后，用Epson V30扫描仪扫描胶。扫描图像中，各位点等位基因的大小范围以及最终数据的格式转换工作均在Excel Microsatellite Tookit V3.1中进行。3个群体中，各微卫星位点中的5组数据计算工作在Popgene 1.31中完成，其中，包括多态信息含量(PIC)[22]、等位基因数(a)、观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)[23]以及有效等位基因数(Ne)[24]。

表1 鼢鼠群体的遗传多样性指数 Table 1 Genetic diversity analyses of plateau zokor

基因座位等位基因数a有效等位基因数Ne多态信息含量PIC观测杂合度Ho期望杂合度HeHW检测ECTL086．0002．2250．4780．3680．5510．0000ECT11011．0002．0030．3090．2060．5010．0000ECTL218．0006．2170．6690．7800．8390．0254EBGA164．0003．4290．6440．7460．7080．8145EBGA287．0002．3830．6170．4380．5800．0000EBGA324．0002．2580．6020．5470．5570．0397EBGA4012．0004．7880．8360．7500．7910．0008EBGA437．0003．9420．4690．5780．7460．0024EBGA549．0004．3030．3380．4840．7680．0000Mean7．5563．5050．5510．5440．6710．0000

3.2 在不同种中扩增状况的差异

通过分析高原鼢鼠中9个微卫星位点的扩增图谱，发现在诸如无论是否进行扩增，无论等位基因长度分布范围如何和无论各位点扩增的等位基因数量为多少等相关问题上，不同种之间存有差异。在等位基因长度分布范围方面，鼹形鼠、甘肃鼢鼠和高原鼢鼠等位基因大小范围有明显的区别。ECT21 位点上，高原鼢鼠的等位基因大小为190～220 bp，明显大于该位点上甘肃鼢鼠的扩增片段。此外，甘肃鼢鼠与高原鼢鼠在ECT110位点上扩增片段的大小不同，同时对EBGA16、EBGA54位点上的扩增片段大小进行比对后，结果表明甘肃鼢鼠与高原鼢鼠同样存在差异(图2)。分析各微卫星位点所得到的等位基因数，结果显示差异同样存在于各种类之间。

此次数据显示，在尘肺病诊断中直接数字化摄影检查和高千伏胸片检查存在较好的一致性，P＜0.05，统计学展现组间分析研究意义。直接数字化摄影检查1000例职业健康查体人员1级片、2级片质量对比高千伏胸片检查显著更高，P＜0.05，统计学展现组间分析研究意义。

如果微卫星核心单元的重复次数发生改变，或者将DNA片段插入侧翼序列中，甚至DNA片段的缺失，无论任何情况皆可使差异出现在不同物种间等位基因长度的分布范围当中[25]。所出现的差异可用于物种的鉴定，尤其对于近缘种的DNA。研究获得部分位点在高原鼢鼠中科进行扩增，但在甘肃鼢鼠中没有多态，是物种特异性的标记。此外，部分位点的等位基因长度分布范围差异明显，可采用作为候选标记，不但可以进行分子鉴定，而且可以进行亲子鉴定，来确定这几种鼢鼠与其杂交后代的关系。等位基因的数量可看做一种参考，来对近缘种进行鉴定[27]。获得的微卫星位点对进一步高原鼢鼠的研究和应用等奠定了基础。

4 结论

从已开发微卫星信息的鼹形鼠科和甘肃鼢鼠物种中进行了高原鼢鼠微卫星多态性位点及其通用性研究，结果表明，在87对微卫星位点中，只有54对进行了成功扩增，多态位点仅有9个，27个鼹形鼠科物种的微卫星在高原鼢鼠中并没有多态性，9个多态位点全来自于同属的甘肃鼢鼠。基于获得的9个多态位点，检测到高原鼢鼠的等位基因数在4～12，其平均观测杂合度(Ho)0.544，期望杂合度(He) 0.671，多态信息含量0.551，研究为高原鼢鼠的微卫星标记应用奠定了基础。

(1) 除套箍指标较小的试件外，所有试件的滞回曲线比较饱满，没有明显捏缩现象，表明高温作用后方钢管再生混凝土柱抗震性能仍具有良好的稳定性。

参考文献:

[1] Litt M,Luty J A.A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotiderepeat within the cardiac muscle actin gene[J].American Journal of Human Genetics,1989,44(3):397.

[2] Santana Q C,Coetzee M P A,Steenkamp E T,et al.Microsatellite discovery by deep sequencing of enriched genomic libraries[J].Biotechniques,2009,46(3):217.

[3] Selkoe K A,Toonen R J.Microsatellites for ecologists:a practical guide to using and evaluating microsatellite markers[J].Ecology Letters,2006,9(5):615-629.

[4] Zane L,Bargelloni L,Patarnello T.Strategies for microsatellite isolation:a review[J].Molecular Ecology,2002,11(1):1-16.

[5] 林能锋,苏永全,丁少雄,等.大黄鱼微卫星标记引物在石首鱼科几个近缘种中的通用性研究[J].中国水产科学,2008,15(2):237-243.

[6] 叶林江,王静,孙鹏,等.四种栲属植物微卫星标记在钩栲中的通用性检测[J].植物分类与资源学报,2014,36(4):443-448.

[7] 邵伟伟,华攀玉,周善义,等.棕果蝠微卫星位点的筛选及其对近缘种的通用性[J].兽类学报,2007,27(4):385-388.

[8] 李华.中国鼢鼠亚科的分类研究[J].首都师范大学学报(自然科学版),1995,16(l):75-80.

[9] 苏军虎,纪维红,南志标,等.鼢鼠亚科Mysopalacinae动物系统学研究现状与展望[J].动物学杂志,2015,50(4):649-658.

[10] 施银柱,边疆晖,王权业.高寒草甸地区小哺乳动物群落多样性的初步研究[J].兽类学报，1991,11(4):279-97.

[11] 崔庆虎,蒋志刚,刘季科,等.青藏高原草地退化原因述评[J].草业科学,2007,24(5):20-26.

[12] 刘锦上,张卫国,江小蕾,等.高原鼢鼠的洞道空间对高寒草甸植被性状的影响[J].草地学报,2011,19(6):927-932.

[13] Zhang Y M,Zhang Z B,Liu J K.Burrowing rodents as ecosystem engineers:the ecology and management of plateau zokors Myospalax fontanierii in alpine meadow ecosystems on the Tibetan Plateau[J].Mammal Review,2003,33(3-4):284-294.

[14] 钟文勤,樊乃昌.我国草地鼠害的发生原因及其生态治理对策[J].生物学通报,2002,37(7):1-4.

[15] 苏军虎,南志标,纪维红.家畜放牧对草地啮齿动物影响的研究进展[J].草业学报,2016,25(11):136-148.

[16] 王海芳,苏军虎,刘荣堂,等.基于线粒体ND4基因的鼢鼠系统进化关系[J].草原与草坪,2008,129(4):20-23.

[17] Begall S,Burda H,Schleich C E.Subterranean rodents:news from underground[M].Springer Berlin Heidelberg,2007.

[18] 王静,纪维红,徐长林,等.达乌尔黄鼠线粒体Cyt b基因序列特征及其系统进化分析[J].草原与草坪,2016,36(3):17-22.

[19] Karanth K P,Avivi A,Beharav A,et al.Microsatellite diversity in populations of blind subterranean mole rats (Spalax ehrenbergi,superspecies) in Israel:speciation and adaptation[J].Biological Journal of the Linnean Society,2004,83(2):229-241.

[20] 苏军虎.青藏高原东缘两类典型土著动物种群遗传结构分析[D].兰州：甘肃农业大学,2014.

[21] 苏军虎,张艳萍,娄忠玉,等.甘肃金鳟AFLP体系建立及应用[J].中国农学通报,2011,27(7):400-404.

[22] Botstein D,White R L,Sckolnick M,et al.Construction of agenetic linkage map in man using restriction fragment lengthpolymorphism [J].Am J Hum Genetic,1980,32(3):314-331.

[23] Nei M.Genetic distance between populations [J].Am Nat,1972,106:283-292.

[24] Crow A J,Kimura M.Evolution in sexual and asexual population[J].Am Nat,1965,99:439-450.

[25] 邹喻苹,葛颂,王晓东.系统与进化植物学中的分子标记[M].北京:科学出版社,2001.

[26] 孙波,鲍毅新,张龙龙,等.大鼠及小鼠微卫星引物在社鼠中的跨种扩增[J].动物学杂志,2009,44(6):145-150.

[27] 陈昌文,曹珂,王力荣,等.中国桃主要品种资源及其野生近缘种的分子身份证构建[J].中国农业科学,2011,44(10):2081-2093.