基于D-loop序列的吉富罗非鱼遗传变异分析

0 引言

吉富罗非鱼(GIFT strains of Oreochromis niloticus)遗传变异分析是为了解决亚洲养殖罗非鱼种群的多态信息含量少、遗传多样性低、种质品质差等问题而开展.在合作执行罗非鱼遗传品质改良计划中,利用DNA分析技术、电泳技术、形态学分析方法对尼罗罗非鱼进行优质种群的收集、评估和选育改良,最后得到的品种[1-3],因其具有抗逆性强、食欲旺盛,生长快、产量高和优质鲜美等优点[4],遂成为优质的水产养殖品种,养殖产业也因此得到了迅速的发展.到目前为止,吉富罗非鱼在我国的水产养殖品种中占有相当大的比例,成了中国的重要水产养殖品种,其不仅养殖规模大,而且经济收益显著,尤其是在广东、广西、海南和福建等沿海地区中可体现,故吉富罗非鱼在一定程度上带动了整个国家的渔业养殖行业的发展[5].由于在鱼类养殖中出现了近亲繁殖而导致种质衰退的现象[4],因此,为维持罗非鱼优良的种质资源和产业的持续发展,必须对其后代进行持续的群体遗传多样性监测.

D-loop区是线粒体DNA中的一段非编码区,属于母系遗传,具有较高的突变率,进化速率快且缺乏基因重组等特点[6-9],因此能积累较多的变异,也正是因为如此,D-loop区被广泛应用于研究群体遗传多样性及遗传分化[10-11].而且相对于随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)、单核苷酸多态性(SNP)等技术而言,利用D-loop区分析群体遗传多样性的结果更准确、更可靠[12],因此该方法更适用于研究群体遗传结构、遗传多样性以及亲缘关系等.本研究利用D-loop区中的799 bp序列分析吉富罗非鱼群体变异和遗传多样性,为吉富罗非鱼种质资源保护和开发提供科学依据.

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用的第20代(13尾)及第21代(38尾)吉富罗非鱼由广东省化州光辉养殖场有限公司从初代吉富罗非鱼根据优良性状选育而来.

人心之于立也,如木之有根,如灯之有膏,如鱼之有水,如农夫之有田,如商贾之有财。——宋·苏轼《上神宗皇帝书》

1.2 基因组DNA提取

取保存于无水酒精中的适量肌肉组织,参照分子克隆实验指南苯酚-氯仿抽提法[13],提取吉富罗非鱼基因组DNA.通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,放置于4 ℃保存备用.

1.3 引物设计

使用MEGA 5.1软件对测序结果进行拼接后,所得D-loop区长度均为799 bp,基于该799 bp的序列分析所得结果显示：两代群体的A与T和C与G的含量较为接近,A + T含量明显高于G + C含量,两代群体的碱基偏倚性与其他脊椎动物相似[10].

使用MEGA 5.1软件对测序结果进行校正,于NCBI数据库进行比对发现与尼罗罗非鱼的D-loop序列一致性在97%-99%之间,结合形态学特征确认为吉富罗非鱼.使用MEGA 5.1软件计算两代群体D-loop序列各自的碱基组成和转换/颠换比值,利用Kimura2-parameter模型计算群体内遗传距离.利用WinArl35软件进行AMOVA分析两个群体遗传差异和群体间分化水平固定指数FST.使用DNASP5软件计算两代群体D-loop序列中的变异位点(Variable sites)、多态性位点(Polymorphic sites)、平均核苷酸差异数(Average number of nucleotide differences)、单倍型数(Number of haplotypes)、单倍型多样性(Haplotype diversity)、核苷酸多样性(Nucleotide diversity)以及Tajima’s D和Fu and Li’s D检验.

1.4 PCR扩增

对两代吉富罗非鱼群体D-loop序列差异进行分子方差(AMOVA)分析,结果如表3所示,群体内遗传差异较大,占96.95%,而群体间的遗传差异仅有3.05%,群体间分化水平固定指数也较小,FST为0.031(P<0.05),结合群体距离分析,群体内遗传距离(0.053和0.078)和群体间遗传距离(0.063)适中且相接近(表4),两代群体遗传分化主要发生在群体内,群体间遗传变异较小,说明两代群体之间并没有因为人工选育而出现明显的分化现象.

具体如表2所示，可见，虽然由于研究例数较少，一些特定并发症的发生率差异不明显，但从整体上看，观察组孕妇的妊娠期并发症发生率显著低于对照组（P＜0.05）。

当天晚上，亚当的家人聚在一起为他办理后事。亚当的大哥斯坦利感到有些头痛，看见亚当的橱柜里有一瓶泰诺速效胶囊，就拿出一粒吃了，又给妻子吃了一粒。

1.5 数据处理

最近，争创“双一流”大学已然成为热词。人们都在思考，怎样才能创好这个双一流？在我看来，这个问题虽然说复杂也够复杂的了，但也并非不能“简而言之”。那就是，什么时候能使高校的师生们有了免于干“无意义的工作”的自由，有了免于“无事忙”的自由，有了免于搞各种形式主义弄虚作假的自由，给他们一个安安静静的办公桌和课桌，这“双一流”也就“行百里半五十”了。（注意，不是“行百里半九十”的意思）

2 结果分析

2.1 序列组成

下载数据库已有的奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼D-loop区引物序列(D-loop-F1：attccacctctaactcccaaagctag/D-loop-R1：cgtcggatcccatcttcagtgttatgctt),由上海生工生物工程有限公司合成.

 

表1 吉富罗非鱼 D-loop区799 bp序列的碱基组成

  

世代碱基组成ATGCG+C20th33．6%31．3%15．4%19．7%35．1%21th33．6%31．5%19．8%15．2%35．0%

2.2 中性检验

对两代吉富罗非鱼群体D-loop序列差异进行中性检验,结果如表2所示,两代群体的Tajima’s D值均为正值且显著(D>0,P<0.05),Fu and Li’s D 分析也得到同样结果,说明两群体进化不遵循中性模型,结合单倍型分析,两代群体以中等频率的等位基因为主,表明两代群体经历了人工选育而造成了稀有等位基因丢失,进而影响了该两群体的进化模式.

 

表2 基于D-loop区的吉富罗非鱼群体中性检验

  

群体数量Tajima’sD/PFuandLi’sD/P20th群体132．02/P<0．051．19/P<0．0521th群体412．40/P<0．051．48/P<0．05

2.3 遗传分化

用于控制区扩增引物的正、反向序列分别为如表1所示.PCR反应体系：10 × Easy Taq Buffer 2.5 μL,dNTP Mixture 2 μL,1 μL 5 μM F/R引物,1 μL DNA模板(200ng/μL左右),5 U/μL Taq DNA polymorase 0.2 μL,用双蒸水补足至25 μL；扩增程序：94 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸30 s,采取30个循环,72 ℃延伸10 min；PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司测序.

 

表3 吉富罗非鱼群体的分子变异分析

  

群体自由度平方和变异组成变异百分比群体间分化指数/P20th群体138．9370．75609Va3．0521th群体521248．58224．01118Vb96．950．031/P<0．05

2.4 遗传多样性

第20代群体的13条D-loop序列保守位点713个,变异位点79个,占9.9%,转换/颠换比值为2.29,各单倍型类型各占1个个体.第21代群体41条D-loop序列保守位点676个,变异位点133个,占16.6%,转换/颠换比值为2.31,单倍型频率最高的是Hap32,占4个个体,Hap2、Hap3和Hap17各占2个个体,其余各占1个个体.两个群体共享单倍型3个,群体遗传多样性数值整体较大,表明群体遗传多样性都处于较高水平.

 

表4 基于D-loop区805bp序列分析的吉富罗非鱼遗传多样性

  

群体变异位点多态性位点单倍型数单倍型多样性核苷酸多样性平均核苷酸差异数群体内遗传距离20th群体7979131．000±0．030．04736．8210．05321th群体133122350．989±0．0090．06651．3830．078

3 讨论

由遗传物质变异积累产生的遗传多样性决定物种的适应能力及进化趋势,遗传多样性就是基因的多样性,而基因多样性就是基因变异的差异大小,即遗传多样性最直接的表达形式就是遗传变异程度[14].本研究结果显示第20代群体变异位点79个,占9.9%,第21代群体变异位点133个,占16.6%,遗传变异适中,低于颉晓勇等研究的尼罗罗非鱼不同世代选育群体D-loop区突变位点的比例(24.94%) [15],与李培等研究的奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼及其杂交子代D-loop区的突变位点的比例(14.9%)相接近[16],表明不同吉富罗非鱼群体D-loop序列变异程度存在差异.群体内遗传距离是衡量群体遗传变异的参数,遗传距离越小,群体遗传变异也越小,反之变异越大.根据遗传距离和AMOVA分析,两代群体内变异适中,群体间遗传变异较小,本实验中的两代群体为连续的两代群体,群体间遗传分化较小且符合实际.遗传变异程度的不同,可能是由于生存环境不同而造成了群体变异速率不一致,不同的选择压力会使群体朝着不同方向进化,而养殖群体会因为养殖环境单一而丢失一些多态信息,趋向于保留适应单一环境的基因型.此外,选育方法同样也会影响群体遗传变异程度,例如选育基础群体数量的限制和近亲繁殖而导致群体逐步纯化.

群体多态性位点数量、单倍型多样性和核苷酸多样性等参数可以判断一个群体的遗传多样性水平[17],这些值越大表明该群体遗传多样性水平越高,而遗传多样性水平是判断群体种质优良程度的参数之一.本实验中的两代群体虽然单倍型较多,但单倍型多样性较丰富(大于0.5),核苷酸多样性>0.005,属于高单倍型多样性和高核苷酸多样性的遗传多样性模式.在野外群体中,该模式说明该群体是由多个群体发生基因二次交流或者群体经过长期演变形成的,遗传变异会受自然选择、人为干扰等因素的影响[18-19].对于本实验养殖群体而言,遗传改良育种就是保留具有优良性状的个体,发挥其种质优势[14].遗传物质变异必定受到养殖和选育的影响,在该群体连续繁殖过程中,选育基础群体个体之间亲缘关系较近,群体内积累了较多的遗传变异,这也说明选育过程中的基础群体种质较优,基础群体本身的遗传多样性较高.本研究中的两代群体的多态性位点比例、核苷酸多样性、单倍型多样性等数值较大,说明两代群体基因变异较丰富,利用微卫星标记技术研究第21代群体也证明该群体的遗传多样性处于高水平[20],而利用ITS1序列分析第21代群体显示其群体遗传多样性较低(未发表),这可能是因为不同序列和技术研究群体遗传多样性存在差异所造成的.随选育世代数的增加,选育群体内遗传差异一般会逐代减小,群体会逐步趋于纯化,本研究中两代吉富罗非鱼群体虽然遗传多样性较高,但需要继续监测后续不同世代的种质,以防止出现种质严重衰退的现象.

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