五种脂肪源对点带石斑鱼(Epinephelus coioides)生长和三种免疫指标的影响

0 引言

石斑鱼味道鲜美、营养丰富,越来越受到广大消费者的欢迎.由于水产品质量安全问题在中国及国际市场上受到的重视程度不断提高,应用水产动物营养学原理,通过外源脂肪源的营养调节作用,提高水产动物的生长和免疫,已成为水产健康养殖研究的主要课题之一,这为石斑鱼的健康养殖提出更高的要求.点带石斑鱼(Epinephelus coioides),广泛分布于我国东南沿海,属于暖水性岛礁鱼类,俗称“青斑”,隶属辐鳍鱼纲,鲈形目,鮨科,石斑鱼属[1].近年来,海南省的石斑鱼养殖发展迅速,据不完全统计,海南省石斑鱼养殖面积2014年达2085.31公顷,2015年达2400公顷[2],2016年石斑鱼产量约8万吨,占全国总产量的8成以上[3].石斑鱼产业正在从传统的低密度养殖转为高密度、集约化、工厂化养殖的模式,伴随着海区水源的污染程度加大、点带石斑鱼品种的退化、抗病力下降、病害的危害[4-6],这些都对点带石斑鱼产业的进一步扩大增加了阻力.

将校长甩得无影无踪后，父亲终于住了脚，弯腰大口大口地喘气。片刻，他抬起头来，无比自信地笑道：“只要留下了东西，你回校读书的事，肯定就有希望了。”

各种食用油不仅可以为水产养殖动物提供能量,而且富含不同种类的不饱和脂肪酸,由于n-3和n-6系列的不饱和脂肪酸是鱼类生长所必需的脂肪酸,所以有关研究饲料中添加食用油对水产养殖动物生长和免疫的影响一直受到研究者的重视.潘瑜[7]研究发现饲料中添加鱼油对鲤鱼(Cyprinus carpio)的特定生长率和饲料系数显著优于豆油组、菜油组和亚麻油组(P<0.05),猪油组的效果最差.王骥腾等[8]研究鱼油、亚麻油、大豆油和菜籽油对军曹鱼(Rachycentron canadum)生长的影响,发现鱼油组的增重率和特定生长率效果显著(P<0.05),鱼油、亚麻油、大豆油的存活率显著高于亚麻油(P<0.05).Lingenfelser[9]研究发现用豆油替代部分鱼油的饲料可使斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)巨噬细胞的杀菌活性降低.Pilarczyk[10]研究发现用亚麻籽油或大豆油完全替代鱼油会显著降低金头鲷(Sparus auratus)头肾白细胞的杀菌活性,但是以亚麻籽油和大豆油1∶1混合后完全替代鱼油,对金头鲷头肾白细胞杀菌活性没有影响.本实验以鱼油、大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油这5种食用油作为不饱和脂肪酸的脂肪源,添加到饲料中,探索5种脂肪源对点带石斑鱼生长和三种免疫指标的影响,为今后石斑鱼配合饲料生产和石斑鱼免疫力研究提供理论依据.

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 饲料和脂肪源

用于实验的颗粒饲料主要由鱼粉、酵母、面粉、酪蛋白、多维等成分组成,干物质的化学组分为粗蛋白44%,粗脂肪15%,灰分11%,糖类20%,水分8%,其他物质2%.花生油和葵花籽油选自“金龙鱼”食用油,大豆油和玉米油选自“福临门”食用油,鱼油选自汤臣倍健股份有限公司.试验组是将鱼油、大豆油、花生油、玉米油和葵花油以5%比例分别与颗粒饲料混合,对照组是不混合外源脂肪酸的颗粒饲料.

1.1.2 试验主要设备和试剂

试验设备主要有麦克奥迪实业集团有限公司的BA310-T型生物显微镜;北京六一仪器厂的WD-9403E紫外分光光度计;北京普朗新技术有限公司的DNM-9602G型酶标分析仪;SIGMA公司的3K15型高速冷冻离心机;姜堰市荣飞器械厂的96孔V型血凝板;浙江飞达金属砂筛厂的100目国家标准检验筛.

抗凝血的制备：用浓度为3000 U/mL的肝素钠溶液润洗一次性1 mL的灭菌注射器,然后对试验鱼进行尾动静脉法采取血液,吸取100 μL抗凝新鲜血于1.5 mL的离心管,用于血细胞呼吸爆发性的测定.

1.1.3 试验鱼和养殖条件

参照冯碧[14]的方法并适当调整.主要步骤包括在96孔板上培养裂解后的巨噬细胞和嗜水气单胞菌,孵育5 h后,用酶标分析仪测得各孔的吸光值.杀菌活性由KI(killing Index)表示,KI=孵育5 h后的吸光值 / 未孵育过的吸光值.

参照刘雪兰[15]的方法,主要步骤包括在96孔V型血凝板上,用生理盐水稀释血清样品(50 μL/孔),分别加入等体积1.2×109 CFU/mL的嗜水气单胞菌悬液,混匀,4℃静置2～4 h.凝集反应中的所有样本设重复3个.凝集结果的判断：如果血清不与细菌发生凝集,则“V”型板的孔底形成界线清晰的小点,判断为“-”;如发生凝集,则在孔底形成均匀不透明薄层,判断为“+”.凝集效价用血清最高稀释度表示.

1.1.4 抗凝血和血清的制备

试验试剂主要有广州市齐云生物技术有限公司的肝素钠;北京索莱宝科技有限公司的Percoll、氯化硝基四氮唑蓝、二甲基甲酰胺.

血清的制备：用一次性1 mL 的灭菌注射器进行尾动静脉法采取血液,将采到的血液置于4 ℃保存4 h,4 ℃条件下4000 r/min 离心10 min 制备血清,血清保存在-20 ℃冰箱中,用于血清凝集效价的测定.

1.1.5 头肾巨噬细胞的制备

参考李庆习[11]的方法并略做调整,主要步骤包括无菌操作取出实验鱼的头肾组织,去除杂物、PBSA洗涤后,在100目的无菌尼龙网上挤压,将得到的细胞悬液600 rpm/min 离心10 min,并将滤液中细胞洗涤三次,离心回收细胞,并调整浓度至1.0×105 cells/mL,最终得到的细胞液用于巨噬细胞杀菌活性的测定.

1.2 方法

1.2.1 生长指标的测定

实验周期共8周,日常记录投喂饲料量、死亡鱼数,增重率、特定生长率、饲料系数、存活率,计算方法如下：

又如，自然资源严重短缺，开发利用不科学、不合理。我国最严重的资源短缺是水资源，据统计，目前在中国有100多个城市都存在严重缺水的现象。我国的人均耕地面积仅有1.4亩，还不到世界人均耕地面积的一半。在中国，人均森林面积为1.9亩，而世界人均占有面积是9.5亩，仅仅是它的1/5；人均森林储积量为9.048立方米，仅为世界人均储积量的1/8。据有关部门估算，中国仅破坏而废弃的土地约2亿亩，而原因是各种的人为因素，可怕的是这个数字每年在持续增大。

增重率(WG, % g/100g)=[(W末重-W初重)/W初重]×100,

特定生长率(SGR, %/d)=100×(Ln W末重-Ln W初重)/ 实验天数,

饲料系数(FCR,g/g)=(W末重-W初重)/饲料量,

存活率(SR)=[(初始鱼数-死亡鱼数)/初始鱼数]×100.

1.2.2 血细胞呼吸爆发性的测定

参照 Song[12]和徐翊轩[13]的氯化硝基四氮唑蓝 (nitroblue tetrazolium chloride,NBT)还原法并适当调整.主要步骤包括将取到的100 μL抗凝新鲜血液中加入等体种0.2%的NBT,37℃孵育30 min,取15 μL 反应液,加入30 μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF),2000 r/min,离心5 min,取200 μL上清液在540 nm下测吸光度,最后与200 μL DMF作为空白对照组的比值作为呼吸爆发性的指标.

1.2.3 巨噬细胞杀菌活性的测定

点带石斑鱼来源于三亚简氏海水苗种繁育农民合作社,鱼体重46±2.8 g,选择体表无病症、摄食正常的健康点带石斑鱼用于试验.每个试验组和对照组设平行组一个,养殖水泥池面积约5 m2,水深1.4 m,水温28～30 ℃,海水盐度30‰,溶氧大于5 mg/L.试验期间,上下午各投喂一次,投喂后换水体积占总水体积的二分之一.

1.2.4 血清凝集效价的测定

定义1.6 设X为一个伪BCI-代数，称X上的一个犹豫模糊集为X的一个犹豫模糊滤子，如果对任意x,y ∈ X,有

1.2.5 数据处理

牛皮糖就沿着渠道岸堤行走了百多步，来到了渠道东头的闸口，旋开了有些生锈的闸门开关，塘坝里的水立刻脱缰的疯牛一般，争先恐后挤出闸口，顺渠道沟前呼后拥而去。大概是放两个响屁的时间，牛皮糖慌慌地又把闸门关了。已经奔出闸口的浪头，以一种幸灾乐祸的势头继续朝前蹿去，一直蹿进渠道尽头的葛藤草窠里方才消失。

试验数据采用平均值±标准差表示,用SPSS 19进行数据分析,进行单因素方差分析(One-Way-ANOVA)和Duncan多重比较,P<0.05表示差异显著.

2 结果与分析

2.1 不同脂肪源饲料对点带石斑鱼生长的影响

8周后,试验组的增重率、特定生长率和存活率与对照组差异不显著(P>0.05);花生油试验组的饲料系数大于其他试验组和对照组,并且和对照组差异显著(P<0.05),其他试验组组间差异不显著(P>0.05)(见表1).说明这5种脂肪源对点带石斑鱼生长的促进作用不显著.

 

表1 不同脂肪源对点带石斑鱼生长的影响 (n=3; X±SD)

  

组别增重率特定生长率饲料系数存活率大豆油252．88±31．272．09±0．141．13±0．16ab88．77±6．55花生油235．19±42．692．00±0．211．27±0．16a97．81±2．51玉米油213．73±7．041．90±0．031．24±0．02ab97．19±2．70鱼油260．63±38．602．13±0．171．10±0．15ab88．15±6．05葵花籽油210．08±16．041．88±0．081．19±0．06ab97．75±1．30对照275．66±40．062．20±0．170．98±0．01b96．78±0．21

注：同一列数据上标字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2 不同脂肪源饲料对点带石斑鱼血细胞呼吸爆发性的影响

第2周,试验组均高于对照组,其中鱼油组最高,但差异不显著(P>0.05);第4周,玉米油、鱼油和葵花籽油组高于对照,但差异不显著(P>0.05);第6周,大豆油、花生油、玉米油和鱼油组高于对照组,其中鱼油组差异显著(P<0.05).第8周,试验组均高于对照组,其中鱼油组最高,但差异不显著(P>0.05)(见下表2).说明在第6周鱼油对点带石斑鱼血细胞呼吸爆发性的提高作用显著.

 

表2 不同脂肪源对点带石斑鱼血细胞呼吸爆发性的影响 (n=3; X±SD)

  

组别检测时间/周2468大豆油1．57±0．171．08±0．762．38±1．19abc1．28±0．40花生油2．69±0．411．15±0．011．41±0．02bd1．26±1．13玉米油1．57±1．152．90±1．641．17±0．45cd1．26±0．36鱼油3．96±2．861．59±0．653．41±0．27a1．58±0．35葵花籽油1．77±0．111．86±0．810．98±0．07d1．25±0．51对照1．21±0．061．15±0．301．13±0．08cd1．05±0．05

注：同一列数据上标字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.3 不同脂肪源饲料对点带石斑鱼巨噬细胞杀菌活性的影响

从KI值的测量结果中,第2周,葵花籽油的KI值虽然低于对照组,但差异不显著(P>0.05);第4周,大豆油和花生油组高于对照组,差异显著(P<0.05);第6周,大豆油、花生油和葵花籽油的KI值低于对照组,但差异不显著(P>0.05);第8周,试验组中除了鱼油组,其他组的KI值均低于对照组,但差异不显著(P>0.05)(见表3).说明第4周大豆油和花生油对点带石斑鱼巨噬细胞杀菌活性的提高作用显著.

小学语文内容学习中，识字教学是其必经过程。学生积累识字的多少会影响其语文写作与阅读能力。目前我国小学识字教学方式比较传统，没有许多丰富的学习内容去提高学生对识字的兴趣和热情。另外，选择怎样的内容来学习也较关键，小学启蒙时期识字内容可以选取易区分且简单的汉字，在有相应识字基础之后再逐渐提升认字量和难度，让小学生对语文课程的识字教学激发强烈兴趣。

本研究以鲁迅小说《离婚》的五个英译本为研究素材。《离婚》是鲁迅以现实生活为题材所写的最后一篇小说。它运用对话的形式展开故事情节，介绍人物。这种文学创作形式在当时的文坛是一种创新。也许正是因为其独特的创作手法吸引了译者们对该小说翻译的兴趣。

 

表3 不同脂肪源对点带石斑鱼巨噬细胞杀菌活性的影响 (n=3; X±SD)

  

组别检测时间/周2468大豆油0．93±0．101．39±0．18a1．14±0．071．06±0．42花生油1．18±0．621．08±0．15ab0．76±0．240．99±0．09玉米油1．38±0．321．14±0．24abc1．42±0．560．89±0．25鱼油2．50±1．940．61±0．03d1．40±0．141．32±0．87葵花籽油0．82±0．300．99±0．01bc1．00±0．221．10±0．04对照0．89±0．230．80±0．02cd1．17±0．191．29±0．28

注：同一列数据上标字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.4不同脂肪源饲料对点带石斑鱼血清凝集效价的影响

第2周,鱼油和葵花籽油的血清凝集效价高于对照组,且在试验组中最高;第4周,鱼油血清凝集效价高于对照组,其他试验组的效价和对照组相同;第6周,大豆油和鱼油的血清凝集效价高于对照组和其他试验组;第8周,所有试验组和对照组的效价相同.说明第6周大豆油和鱼油对点带石斑鱼血清凝集效价的提高作用较好(见表4).

 

表4 不同脂肪源对点带石斑鱼血清凝集效价的影响 (n=3; X±SD)

  

组别检测时间/周2468大豆油2-32-42-52-4花生油2-22-42-32-4玉米油2-32-42-32-4鱼油2-42-52-52-4葵花籽油2-42-42-32-4对照2-32-42-32-4

3 讨论

3.1 不同脂肪源饲料对点带石斑鱼生长的影响

在饲料中添加不饱和脂肪源对水产品生长的影响研究较多,其中鱼油作为重要的外源脂肪源在生产中应用较普遍,但由于鱼油价格较高,增加了饲料的投入成本,所以,用价格相对较低的植物油替代鱼油、研究鱼油和植物油对水产动物生长的影响一直受到研究者的重视.徐后国[16]研究饲料中的二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)的比例对鲈鱼(Lateolabrax japonicus)幼鱼生长的影响,发现DHA/EPA的值从0.55升高至2.08时,特定生长率和饲料效率显著升高(P<0.05),但成活率变化不显著.冯健等[17]研究发现饲料中添加大豆磷脂的淡水太平洋鲑(Oncorhynchus spp.)生长性能最好,而添加鱼油、大豆油、玉米油的效果相似.高艳玲[18]对比大豆油、菜油、油菜籽油和猪油4种不同脂肪源饲料对团头鲂(Megalobrama amblycephala)幼鱼生长和身体组成的影响,发现豆油、菜油、猪油和油菜籽的脂肪酸组成种类和数量能满足团头鲂正常生长所需,可以作为团头鲂饲料脂肪源.本研究发现,通过8周的投喂,5种外源脂肪源饲料对点带石斑鱼增重率、特定生长率和存活率的提高作用不显著(P>0.05);花生油组的饲料系数大于其他试验组和对照组,并且和对照组差异显著(P<0.05),表明花生油组降低了试验鱼对饲料的利用效果,在饲料系数层面反映出的对生长指标的影响效果最差.

由于农民环保意识不强、秸秆回收成本较高、政府财政资金支持不足以及相关产业发展滞后等原因，秸秆焚烧难以禁止。要从根本上解决秸秆禁烧难的问题，必须坚持“疏堵结合、以疏为主”的思路。

3.2 不同脂肪源对点带石斑鱼血细胞呼吸爆发性的影响

呼吸爆发性是一种古老的自然免疫反应,它是由巨噬细胞、吞噬细胞、中性粒细胞等具有吞噬功能的细胞在将外源异物吞噬后,在细胞内将分子氧转化为氧离子,而这种活性氧对于外源异物具有较强的杀伤力[19].同进,呼吸爆发性和血细胞、吞噬细胞的杀菌活力是互相关联的,它是鱼类等生物重要的细胞免疫能力强弱的指示物.有关脂肪源对鱼类血细胞的呼吸爆发性研究较少,而针对外源性的饲料添加剂对水产动物血细胞的呼吸爆发性研究较多.有学者将枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂投喂露斯塔野鲮(Labeo rohita)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus),结果表明可以显著提高血细胞的呼吸爆发性(P<0.05)[20-21].徐翊轩[13]研究发现脂多糖可以增强栉孔扇贝( Chlamys farreri )血细胞的呼吸爆发活性,但是剂量与增强效果并没有出现相关性.在饲料中添加葡聚糖可以在短期内促进斑节对虾(Penaeus monodon)的呼吸爆发性,但添加浓度要严格控制,当浓度为2.0 L/g时,会对鳃组织造成不同程度的病变[22].本研究发现,在第2、4、8周,试验验和对照组的效果不显著,在第6周,鱼油组的血细胞呼吸暴发值高达0.98±0.07,与对照组差异显著(P<0.05),效果最好.

3.3不同脂肪源对点带石斑鱼巨噬细胞杀菌活性的影响

巨噬细胞有识别、吞噬外来病原微生物等异物的功能,是鱼类重要的免疫细胞,它的活性和功能是衡量鱼类免疫水平的重要指标之一,饲料中的脂肪源种类对巨噬细胞的杀菌活性影响较大.有研究发现,饲料中若n-3不饱和脂肪酸含量不足可引起虹鳟(Oncorhynnchus mykiss)的巨噬细胞杀菌活性降低,如果不饱和脂肪酸含量充足,巨噬细胞杀菌活性能力提高,而且抗体含量增加[23].饲料中的n-3 不饱和脂肪酸在一定范围内,其含量与杀菌活性正相关,但过高剂量会降低斑点叉尾鮰吞噬细胞的吞噬能力和杀菌活性[24].本研究发现,第2、6、8周,试验组的巨噬细胞杀菌活性和对照组相比效果不明显,第4周,豆油和花生油组高于对照组,差异显著(P<0.05),而富含n-3不饱和脂肪酸的鱼油组比对照组的杀菌活性还低,这可能与脂肪源投喂的周期、饲料中的含量有关.

3.4 不同脂肪源对点带石斑鱼血清凝集的影响

凝集素是一种对特异糖残基有高度亲和力的蛋白质,被认为是鱼类自然免疫机制中原始的识别分子和免疫监督分子,在鱼类体液免疫中发挥着重要作用,血清凝集素滴度是对凝集效果最直观的指示参数.鱼油可以提高鱼类的血清凝集素滴度,如果给对虾(Penaeus stylirostris)投喂含7%鳕鱼油的颗粒料4周,其血液凝集素滴度极显著高于对照组,用含10%鱼油的颗粒料投喂鲤鱼8周,其血液凝集素滴度也高于对照组[25].本研究发现,在第2、4、6周,鱼油、葵花籽油和大豆油的血清凝集效价有时高于对照组,其中鱼油的提高作用最好,第8周,所有试验组和对照组的效价相同.说明富含n-3不饱和脂肪酸的鱼油可以增强鱼、虾的凝集素活力,增强其非特异性免疫功能.

综上所述,饲料中添加的5种脂肪源只有鱼油对点带石斑鱼生长、呼吸爆发性和凝集效价的提高作用较好,说明点带石斑鱼生长、免疫力与饲料中的脂肪源种类有关联.同时,脂肪源对生长和免疫力的影响作用还与其剂量有关,这也可能是本试验中其他脂肪源对生长、免疫指标没有提高作用的原因.因此,今后有必要针对脂肪酸源不同种类的混合配比和添加剂量进一步展开研究.

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