缺氧环境下自噬对内皮祖细胞迁移及凋亡的影响

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮的前体细胞，主要参与了受损内皮的修复。EPCs从骨髓、脾脏等部位动员、迁移、归巢至血管损伤部位，在多种激素或细胞因子刺激下分化为成熟内皮细胞(endothelial cells，ECs)从而修复损伤血管，其作用在急性心肌梗死、缺血再灌注损伤、糖尿病视网膜病变、肢体缺血等血管病变中均有报道[1]。然而传统以EPCs移植为基础的细胞治疗，在移植后普遍面临缺血缺氧等恶劣环境[2]，这导致移植后细胞存活率较低，制约了EPCs移植向临床的转化。因而明确EPCs在缺血缺氧等应激状态下的存活机制，对提高移植治疗效果、加强病理状态下的血管修复有积极的指导作用。自噬(autophagy)作为真核细胞降解胞内蛋白、细胞器的重要方式，对干细胞的发育、分化、存活和归巢都有重要作用[3-4]。本课题组前期研究发现自噬对氧化应激下EPCs的增殖存活发挥了保护作用[5]，但缺氧环境下自噬对EPCs迁移、凋亡等过程有何作用还有待研究。因此，本实验旨在观察缺氧环境下自噬对EPCs迁移及凋亡的影响，初步探讨自噬在其中发挥的作用，为缺氧环境下EPCs移植修复血管提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 DMEM培养基和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司，EGM-2MV培养基购自瑞士Lonza公司，微管相关蛋白1轻链3(LC3)抗体、自噬相关蛋白-7(Atg7)抗体、SQSTM1(p62)抗体购自美国Cell Signal Technology公司，β-肌动蛋白(β-actin)抗体购自美国Santa Cruz公司，淋巴细胞分离液购自美国Sigma公司，Annexin V-PE和7-AAD染液购自中国凯基生物技术公司。Transwell小室(Corning公司，美国)；倒置显微镜(Olympus公司，日本)；细胞培养箱(Kendro公司，美国)；激光共聚焦显微镜(Leica公司，德国)；流式细胞仪(Beckman Coulter公司，美国)。

辣椒的辣感来源于果实所含辛辣成分如辣椒碱、二氢辣椒碱、降二氢辣椒碱、高辣椒碱、高二氢辣椒碱等；另外如壬酰香荚兰胺、辛酰香荚兰胺等决定了辣椒特殊的体香；而诱人的肤色则是依靠内在有辣椒红素、隐黄素、辣椒玉红素等的衬托；而胡萝卜素、维生素C、柠檬酸、酒石酸、苹果酸变成了它的钗头凤。

1.2 EPCs的分离鉴定及培养 成年雄性SD大鼠由新桥医院实验动物中心提供。取大鼠胫、腓骨，PBS冲洗后收集骨髓腔冲洗液，密度梯度离心后将分离出的细胞接种于EGM-2MV的培养基中进一步培养。为证实EPCs的表型，我们采用荧光双染法鉴定EPCs，在培养的细胞中依次加入DiI-acLDL和FITC-UEA-I，通过流式细胞术双染阳性被确定为EPCs。

试验地位于祁连山东端的华藏林区，地理坐标为东经102°44′～103°08′、北纬37°11′～37°21′。林区地貌为高、中山区和低山丘陵，以低山丘陵区为主，山脉主要走向由西转向东北，地势南高北低，海拔在2700～3200m。气候为典型的大陆性寒冷干旱、半干旱气候，年均气温0.8℃，最低气温-12.2℃，最高气温11.3℃；极端最高气温26.7℃，极端最低气温-30.6℃。雨季集中分布在7、8月和9月上旬，年降雨量350～500mm，年蒸发量1400mm左右。试验地乔木林以青海云杉为主，另有少量的桦类、山杨等，林下仅有苔藓和少量低矮草本植物，少有灌木。

1.3 缺氧处理EPCs及分组 分离培养的EPCs每隔24h换液1次，待细胞密度为80%时，常规进行消化传代。为检测缺氧对EPCs迁移、凋亡及自噬水平的影响，我们将细胞分为4组：常氧培养组(即缺氧0h组)，缺氧1h组，缺氧3h组和缺氧6h组；为检测缺氧环境下自噬对EPCs的作用，我们将细胞分为4组：常氧培养组(即缺氧0h组)，缺氧3h组，缺氧3h+沉默Atg7(ShAtg7)组和ShAtg7组。常氧培养条件为：37℃、5%CO2、21%O2、74%N2常氧培养箱中常规培养，缺氧培养条件为：37℃、5%CO2、1%O2、94%N2低氧培养箱中低氧培养。

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1.4 流式细胞术检测凋亡率 按前述实验分组处理EPCs后，收集各组细胞上清液于对应离心管，PBS洗涤1次后用胰酶消化贴壁细胞1min，加入完全培养基终止消化，收集培养液与对应组的上清液细胞混合，1000×g离心3min，PBS洗涤2次后制备细胞悬液，加Annexin V-PE(AV-PE)和7-AAD染色，流式细胞仪检测各组EPCs凋亡率。

[8]Blasiak J, Petrovski G, Veréb Z, et al. Oxidative stress, hypoxia,and autophagy in the neovascular processes of age-related macular degeneration[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014: 768026.

自噬作为一种应激调控机制，在维持细胞正常功能中发挥着重要作用。既往研究表明适度激活的自噬可促进清除损伤的细胞器、细胞内代谢产物及突变基因，以延长细胞寿命[10]。近年来自噬与心血管疾病的联系逐渐受到关注，尤其在缺氧缺血性血管疾病、缺血再灌注损伤[7,11]等疾病中受到广泛研究，但自噬对于缺氧环境下EPCs的作用还有待进一步研究。目前关于缺氧激活细胞自噬的途径主要集中在对HIF-1α的研究上[12]，HIF-1α被认为是缺氧激活自噬的始动因子。Wang[13]的研究指出，由HIF-1α介导的自噬可增加细胞凋亡及氧化应激反应，并且这种损伤可被自噬抑制剂3-MA所阻断。BNIP3/BNIP3L是缺氧诱导自噬发生的重要分子，缺氧时HIF-1α能使BNIP3/BNIP3L表达增加，竞争性地使Beclin-1从Bcl-2/Beclin-1复合体中解离并释放，Beclin-1通过PI3K/AKT途径调节下游多种自噬相关蛋白，从而激活缺氧诱导的自噬[11]。另外严重的缺氧可造成细胞内线粒体畸形和损伤，使线粒体内钙超载，同时产生并释放活性氧(ROS)、细胞色素C等物质，上调细胞凋亡蛋白酶(caspase)，促进细胞凋亡或坏死[14]，而自噬能清除受损线粒体及蛋白质，降低ROS细胞毒性，并维持细胞内能量稳定。上述为缺氧激活细胞自噬过程中可能存在的几种途径，在EPCs中仍有待进一步研究。

1.7 Transwell侵袭小室实验 取对数生长期的EPCs，调整细胞密度为3×104个/ml，在铺好胶的上室中加入200μl细胞悬液(不含血清)，下室加入500μl含VEGF的EGM-2培养液，每组设3个复孔，按前述实验分组对EPCs进行孵育。孵育结束后从小室取出各组EPCs，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗涤细胞3次，结晶紫染色10min，倒置显微镜下计数细胞数并拍照，随机选择视野进行统计分析。

1.8 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对数据进行分析。实验数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，进一步两两比较采用LSD-t检验，实验重复≥3次。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 缺氧对EPCs迁移能力的影响 取缺氧0、1、3、6h分组处理EPCs后，利用经典的Transwell小室迁移实验比较各组EPCs迁移能力的变化。结果显示，随着低氧暴露时间的延长，EPCs迁移能力逐渐降低。常氧培养组(即缺氧0h组)，显微镜下平均每视野EPCs为50.6±5.2个，缺氧培养3h后平均每视野EPCs减少为36.60±3.36个(P<0.05)，缺氧培养6h后平均每视野EPCs进一步减少为28.80±4.38个(P<0.05，图1)。

2.2 缺氧对EPCs凋亡的影响 我们用Annexin V-PE(AV-PE)和7-AAD双染色标记细胞，并采用流式细胞仪检测各组EPCs凋亡水平。结果显示，随着低氧暴露时间的延长，EPCs凋亡率逐渐升高。常氧培养组(即缺氧0h组)凋亡率为3.87%±0.55%，缺氧3h后凋亡率(6.85%±0.91%)明显升高(P<0.05)，缺氧6h后凋亡率(9.60%±0.78%)较缺氧0h组进一步升高(P<0.05)，与缺氧3h组相比凋亡率也有明显升高(P<0.05，图2)。

  

图1 缺氧对EPCs迁移的影响(Transwell小室)Fig.1 Influence of hypoxia on EPCs migration (Transwell chambers)

 

(1)P<0.05 compared with 0h, (2)P<0.05 compared with 3h

  

图2 缺氧对EPCs凋亡的影响(流式细胞仪)Fig.2 Influence of hypoxia on EPCs apoptosis (Flow cytometry)

 

(1)P<0.05 compared with 0h, (2)P<0.05 compared with 3h

2.3 缺氧对EPCs自噬的影响 Western blotting检测结果显示，随着缺氧时间的延长，EPCs自噬关键蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化增加，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增大，在缺氧3h后差异有统计学意义(P<0.05)，自噬泛素化底物p62逐渐减少，在缺氧3h后差异有统计学意义(P<0.05，图3)。根据迁移和凋亡结果，结合文献[6]报道，后续研究我们采用1%氧浓度培养3h作为缺氧模拟条件。

[2]Chong MS, Ng WK, Chan JK. Concise review: endothelial progenitor cells in regenerative medicine: applications and challenges[J]. Stem Cells Transl Med, 2016, 5(4): 530-538.

综上所述，本研究证实，缺氧可减弱EPCs的迁移能力并增加细胞凋亡，同时可激活EPCs自噬。通过适度正向调控EPCs自噬，可增强细胞迁移、抑制凋亡，从而提高EPCs生存能力。该结果将有助于为缺血再灌注损伤、缺血缺氧性心血管病等疾病治疗提供一种新的策略，也为后续的深入实验研究奠定了基础。

  

图3 缺氧对EPCs LC3-Ⅱ/Ⅰ及p62表达的影响(Western blotting)Fig.3 Influence of hypoxia on the expressions of LC3-Ⅱ/Ⅰ and p62 (Western blotting)

 

(1)P<0.05 compared with 0h, (2)P<0.05 compared with 3h

  

图4 沉默Atg7表达后缺氧对EPCs凋亡的影响Fig.4 Influence of hypoxia on EPCs apoptosis after silencing Atg7 expression

 

A-B. Using lentiviral vector (LV) carrying Atg7 shRNA to silence autophagy; (1)P<0.05 compared with control; (2)P<0.05 compared with VC. C-D. Using flow cytometry to detect hypoxia-induced EPCs apoptosis after silencing Atg7; (1)P<0.05 compared with hypoxia 0h; (2)P<0.05 compared with hypoxia 3h

  

图5 沉默Atg7表达后缺氧对EPCs迁移的影响(Transwell小室)Fig.5 Effects of hypoxia on EPCs migration after silencing Atg7 expression (Transwell chamber)

 

(1)P<0.05 compared with hypoxia 0h; (2)P<0.05 compared with hypoxia 3h

3 讨 论

本研究结果表明，缺氧环境下大鼠骨髓来源的EPCs迁移能力下降，细胞凋亡率升高，同时，缺氧使EPCs内LC3-Ⅱ/Ⅰ表达增高，p62表达降低，证实缺氧是自噬的重要激活因子[7]。沉默Atg7抑制自噬后发现，与缺氧3h组比较，缺氧3h+ShAtg7组的EPCs迁移能力进一步降低，细胞凋亡率进一步升高，说明自噬在缺氧造成的损伤中发挥了保护作用。EPCs迁移和凋亡都受到自噬的影响，因此，缺氧在抑制EPCs迁移、增加细胞凋亡的同时，激活的自噬可降低缺氧对EPCs的损伤，恢复部分EPCs迁移并减少凋亡，增加EPCs的存活率。

缺氧激活的自噬与细胞凋亡及迁移联系紧密。研究发现缺氧环境下AKT和NF-κB通路对调控EPCs迁移和内皮分化发挥着重要作用[15]，同时细胞自噬与凋亡存在共同通路，例如通过PI3K/AKT/mTOR途径调节细胞凋亡与自噬，且PI3K/AKT/eNOS途径对EPCs动员、迁移及分化都发挥着重要作用[16]。适度的低氧可激活自噬，清除细胞内的变形蛋白及衰老细胞器并提供细胞代谢所需的原材料，促进细胞在缺氧环境下的生存。然而，当缺氧暴露时间持续延长或程度加重时，自噬将被过度激活，细胞将出现自我消化，进一步导致细胞自噬性死亡或者凋亡[17-18]。因此，自噬作为一把双刃剑，在保护细胞的同时也可能对细胞产生不良影响。在本研究中，我们并未采用传统自噬诱导剂如mTOR抑制剂(雷帕霉素)、IP3R阻滞剂[19](Xestospongin C)，因为此类自噬诱导剂常造成细胞自噬激活过度，引起细胞内细胞器及蛋白过度降解，导致细胞自噬性死亡或者凋亡的发生[20]，从而掩盖自噬对细胞的保护性作用。在后续的研究中，我们将进一步筛选及探讨激活自噬的药物，通过调控适度的自噬从而达到保护应激环境下EPCs生物学功能的作用。

1882年由本特里公司(Bentley’s)出版的首部奥斯汀小说全集将奥斯汀的形象与英格兰农村的建筑——乔顿乡村教堂和史蒂文屯牧师住宅的木刻画——联系起来。这种将“奥斯汀”与田园古宅相连的传统还传达了奥斯汀对乡村农舍的由衷喜爱。这里需要指出的是，奥斯汀主要描绘的农舍不是穷苦的农舍农的居所，而是达什伍德太太这样落魄乡绅阶层，或是埃德蒙·伯伦特等这样的牧师，或是韦斯特先生这样的新兴力量所居住的新农舍。虽然比不上庄园的豪华与现代，却也方便、舒适，功能齐全。

1.6 自噬相关蛋白Atg7沉默 慢病毒载体(LV) Atg7 shRNA由汉恒生物技术(上海，中国)构建。在骨髓来源的单核细胞(BMNCs)播种2d后，按照感染复数(multiplicity of infection，MOI)为100加入病毒。转染液培养基在48h后换为新鲜培养基继续培养。Western blotting检测分为空白对照组(control)、空载组(vector control，VC)及ShAtg7组，以期验证EPCs中Atg7的敲减效率。

在人体的大部分组织中，氧浓度低于3%被视为是一种低氧环境[8]，本研究采用的是1%氧浓度的低氧培养箱处理细胞，由于长期缺氧可导致细胞大量死亡，使自噬作用难以体现，因此本研究采用短期缺氧处理1、3、6h后观察EPCs迁移能力及凋亡数目变化。文献报道处于胚胎期及骨髓内的EPCs常处在低氧状态[9]，当血管受损等发生时，EPCs动员至损伤处分化为内皮细胞，缺氧可以明显增强缺氧诱导因子(HIF-1α)、趋化因子受体4(CXCR4)、VEGF等因子的表达，从而提高EPCs迁移、分化、增殖能力[6]，因此缺氧预处理EPCs可增强细胞的抗凋亡能力。但是，缺氧预处理对EPCs生物学功能影响的最佳时间条件不甚明确，这可能与体内缺氧环境有多种神经体液调节共同作用有关。本实验中，使用1%氧浓度缺氧处理3h后即对EPCs的迁移及凋亡产生明显影响，说明体外环境下短期低氧处理即可激活EPCs凋亡通路并抑制迁移相关蛋白，使EPCs迁移能力减弱，凋亡增加。

同时，我们利用Tanswell小室再次检测抑制自噬后细胞迁移数目的改变，结果显示，缺氧3h组EPCs迁移数目(34.00±3.53)明显低于缺氧0h组(47.80±7.50，P<0.05)，缺氧3h+ShAtg7组EPCs迁移数目(23.60±3.51)与缺氧3h组相比，EPCs迁移数目进一步减少(P<0.05，图5)。

【参考文献】

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2.4 缺氧激活的自噬在EPCs迁移和凋亡中作用我们采用慢病毒转染方式稳定沉默自噬蛋白Atg7，Western blotting验证Atg7被成功敲除，空载组(vector-control，VC)Atg7表达差异无统计学意义(P>0.05)，LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62表达变化证实沉默Atg7后自噬被成功抑制(图4A、B)。我们再次利用流式细胞仪分析抑制自噬后细胞凋亡率的改变，结果显示，缺氧3h组EPCs凋亡率(6.68%±0.95%)与缺氧0h组(3.45%±0.79%)比较明显升高(P<0.05)；缺氧3h+ShAtg7组EPCs凋亡率(8.41%±1.08%)与缺氧3h组相比，凋亡率进一步升高(P<0.05，图4C、D)。

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著名教育家叶圣陶说：“教育就是习惯的养成。”我们要努力形成一种学习的正气，使每一位同学都认识到独立完成作业是光荣的，而抄袭是可耻的，形成正确的荣辱观，这是我们当代教师的职责所在。

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二环路标准横断面为四幅路形式，可供安装喷洒装置的位置包括中央隔离带以及主辅隔离带。从管线布设空间、喷洒方向与路拱横坡的结合方式、施工难度、后期维护等方面进行综合比选，优缺点对比见表1。

其诗题有《乡人或病予诗多道蜀中遨乐之盛，适春日游镜湖，共请赋山阴风物，遂即杯酒间作四绝句，却当持以夸西州故人也》。

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事实上,假设子列{xnk}是关于ρπ的Cauchy-列,且收敛到0,则对任意的0<ε<1,存在N,使得当s,t>N时,令t→∞,则有矛盾，因此δ=0的情况不存在。

1.5 Western blotting检测 收集各组细胞，预冷PBS洗涤3次，加入细胞裂解液，离心后提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定样本蛋白质浓度。按每泳道50μg上样量，进行10% SDS-PAGE电泳后，转至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭1h后，加入一抗在4℃条件下孵育过夜(一抗采用LC3、p62和β-actin，1:1000)，TBST洗涤3次，加入二抗标记有辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体(1:5000)，37℃室温孵育1h，TBST洗涤3次，ECL显影，利用Image J软件进行半定量分析。

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声发射能量是指事件信号检波包络线下的面积，它可以反映事件的相对能量和强度。将实验中两类传感器采集的信号绘制成能量-时间-轴向力关系曲线，对比两种传感器的特点。通过对所有试件的实验结果进行数据分析，每组试件的数据呈现出相同的规律，限于篇幅本文只选取了部分试样的实验研究结果作为代表。

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这是《宋书·谢灵运传》全文所载的谢灵运的《山居赋》的部分内容，所描述的是作者祖父谢玄所开拓、作者所扩建的“始宁墅”山居庄园的景致，“可以说是两晋、南北朝时期所兴起的自然、田园诗文的代表作；它同时表达了当时风行的自然审美观和园林观；赋中涉及园林创作的利用自然以及对景、借景等景象组织的处理”[8](P421)。

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