归芪益元膏对重离子辐射旁效应损伤大鼠肺肾组织caspase-3及caspase-9表达的影响

重离子(12C6+)被誉为21世纪最理想的肿瘤放疗用射线，但在临床上用重离子束照射肿瘤部位时，病灶周围未受到直接照射的细胞会接受已照射细胞释放的损伤信号产生辐射旁效应[1]，包括DNA损伤、细胞增殖或凋亡、基因表达改变、表观遗传学改变、炎症反应、致瘤性转化甚至癌症形成等[2-4]。辐射旁效应的防护是辐射生物学和临床癌症治疗领域的重要研究内容。中药因资源丰富、毒副作用小、整体调治、防治结合等优点，目前已成为辐射防护剂的研究热点[5-7]。归芪益元膏源自《医学心悟》之黄芪汤[8]，加甘肃道地药材当归而成，全方具有益气滋阴、养血活血之效。本实验探讨重离子辐射诱发体内旁效应中caspase-3、caspase-9基因表达的变化以及归芪益元膏的干预作用，以期为重离子辐射旁效应损伤的中医药防护提供实验依据。

要组建地方金融控股平台，进一步优化金融产业空间布局，推动国有资本控股、参股地方金融企业，培育各类创新型金融机构，全力争取各类地方金融牌照，推进地方金融体系建设。2018年完成政策性小额贷款公司组建，2019年完成保险经纪公司组建，到2020年基本建成具有地方特色的金融服务保障系统，形成银行、保险、基金、租赁、小贷、担保、典当等一体的经营格局，成为西部领先、国内知名的地方金融控股集团。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器 多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司)；DAB试剂盒、抗体稀释液、免疫组化SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；兔抗caspase-3多抗(美国ImmunoWay公司)；兔抗caspase-9抗体(美国博奥森生物技术有限公司)；反转录试剂盒、SYBR Fast qPCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；引物设计合成(上海生工生物工程有限公司)。D37520型低温高速离心机(德国Kendro公司)；PRO200型组织匀浆器(美国Bio-Gen公司)；041BR109973型电泳仪、C1000型荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；M-2016型石蜡切片机、TECVEM-J2型石蜡包埋机、VIP-5JR-J2型自动组织脱水机(德国Leica 公司)。

1.2 药品制备 归芪益元膏组成：黄芪30g，当归、熟地、麦冬、人参、枸杞子各15g，五味子10g。方中原药材由甘肃省高校中藏药化学与质量控制实验室提供并进行质量鉴定，鉴定人为魏舒畅教授。归芪益元膏制备(甘肃中医药大学中药制药实验室)：按处方剂量称取药材，以水作溶剂提取两次，第1次用水量为总药材剂量的8倍，第2次为总药材剂量的6倍，每次提取2h；合并两次提取的药液，300目滤布过滤，滤液减压浓缩后加制剂辅料(防腐剂、增稠剂等)制成膏剂，膏剂浓度为1.64g/ml。

1.3 实验动物及分组 SPF级雄性Wistar大鼠42只，体重200±20g，由甘肃中医药大学S P F级实验动物中心提供并饲养[合格证号SCXK(甘)2015-0002]。采用随机数字表法将大鼠随机分为正常对照组(NC组)、单纯辐射组(RO组)，中药组(CM组)，后两组按照射后处死时间再分为6、12、24h亚组，每组6只。中药组以归芪益元膏灌胃2周，灌胃剂量按照体表面积折算法，大鼠每日给药剂量约为人临床用量的10倍，即3.28g/(kg.d)，NC组和RO组以等量生理盐水灌胃。

1.4 动物照射 照射前大鼠腹腔注射10%水合氯醛(剂量0.3ml/100g)麻醉。RO组和CM组大鼠右肺给予2Gy 12C6+离子束单次照射，铅皮屏蔽身体其余部位，NC组给予相同方式麻醉，但不照射。重离子照射在中国科学院近代物理研究所兰州重离子加速器研究装置的浅层肿瘤治疗终端上进行，束流为12C6+离子束。坪区照射，能量为165MeV，LET为20keV/μm，吸收剂量率为2Gy/min，用空气电离室监测剂量，照射剂量为2Gy。

[2]Li PT. Low concentration of exogenous carbon monoxide protects mammalian cells against proliferation induced by radiation induced bystander effect[J]. Mutat Res, 2014, 759(2):9-12.

1.6 RT-qPCR检测肺肾组织caspase-3、caspase-9 mRNA水平 采用Trizol法从肺、肾组织中提取总RNA，反转录成cDNA；以cDNA为模板，进行qPCR，引物序列见表1。反应体系：SYBR Fast qPCR Mix(2×)12.5μl，引物2μl，cDNA 2μl，加灭菌蒸馏水至25μl；反应条件：95℃预变性10min，然后95℃ 5s、60℃ 10s，循环40次。以β-actin为内参，用2–ΔΔCt法进行相对定量分析。

 

表1 各目的基因及内参引物序列Tab.1 Primer sequences of target genes and reference gene

  

Gene name Primer sequences β-actin F:5'-TTGTAACCACCTGGGACTAGATGG-3'R: 5'-AACACAATCTCCACGATAGCAG-3'Caspase-3 F: 5'-GAGACAGACAGTGGAACTGACGATG-3'R: 5'-GGCGCAAAGTGACTGGATGA-3'Caspase-9 F: 5'-CTGAGCCAGATGCTGTCCCATA-3'R: 5'-GACACCATCCAAGGTCTCGATGTA-3'

1.7 免疫组化检测肺肾组织caspase-3、caspase-9蛋白水平 常规石蜡包埋各组大鼠肺肾组织，切片厚度4μm，经脱蜡、水化、修复后，封闭并加抗体孵育，显色、脱水、封片后，光学显微镜下读片拍照，用BI-2000免疫组化分析软件计算图片平均灰度值，并进行分析统计(用平均灰度值来表示蛋白相对表达量，灰度值越大，蛋白表达量越低)。

本实验结果显示，2Gy 12C6+离子照射大鼠右肺部后，右肺、左肺、左肾中caspase-3、caspase-9 mRNA表达在照射后6、12、24h均明显升高，蛋白表达在照射后24h明显升高。该结果表明未直接照射的左肺和左肾出现了与直接照射组织右肺类似的凋亡基因异常表达现象，未受照射组织也对辐射产生了响应，辐射诱导了体内旁效应的产生。预先灌胃归芪益元膏后，大鼠右肺、左肺、左肾中caspase-3、caspase-9 mRNA及蛋白表达较同时间点的RO组下调，表明预先灌胃归芪益元膏可以在一定程度上逆转caspase-3、caspase-9 mRNA及蛋白表达量的升高，提示归芪益元膏可以通过抑制caspase级联反应起到保护肺肾细胞、减缓肺肾细胞凋亡的作用。

2 结 果

培元固本、益气滋阴养血、整体调治为中医药防护辐射旁效应损伤的基本原则，归芪益元膏切合辐射旁效应损伤的中医病机。方中重用黄芪以补中益气，壮后天之本，使元气充实；配伍当归补气以生血、养血活血；配伍人参大补元气，生津养血；熟地补血滋阴，益精填髓；枸杞补肾滋阴；麦冬清热生津，养阴润肺；五味子益气生津，滋补肺肾。诸药合用共奏益气滋阴、养血活血之效，使得“正气存内，邪不可干”，起到防护辐射损伤的作用。

 

表2 归芪益元膏对大鼠肺肾组织caspase-3和caspase-9 mRNA水平的影响(±s，n=6)Tab.2 Effects of Guiqiyiyuan Ointment on the levels of caspase-3 and caspase-9 mRNA in lung and kidney tissues of rats (±s, n=6)

  

NC. Normal control; RO. Radiation only; CM. Chinese medicine; (1)P<0.01 compared with NC group; (2)P<0.01 compared with RO group

 

Group Right lung Left lung Left kidney Caspase-3 Caspase-9 Caspase-3 Caspase-9 Caspase-3 Caspase-9 NC group 1.00± 0.02 1.00±0.05 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.06 1.00±0.03 RO group 6h 3.52±0.16(1) 10.46±0.35(1) 2.28±0.10(1) 7.31±0.29(1) 1.53±0.05(1) 5.05±0.15(1)12h 5.97±0.19(1) 13.28±0.48(1) 2.84±0.04(1) 6.24±0.23(1) 1.76±0.04(1) 5.21±0.19(1)24h 5.68±0.49(1) 13.90±0.43(1) 3.54±0.04(1) 9.54±0.21(1) 2.17±0.08(1) 6.50±0.12(1)CM group 6h 3.18±0.20 9.24±0.27(2) 2.43±0.03 6.95±0.29 1.30±0.04 4.00±0.06(2)12h 5.28±0.13(2) 12.27±0.22 2.57±0.06 5.33±0.22(2) 1.45±0.06(2) 4.85±0.08(2)24h 4.47±0.08(2) 11.54±0.60(2) 2.50±0.07(2) 4.52±0.30(2) 1.47±0.03(2) 4.84±0.13(2)

2.2 归芪益元膏对大鼠肺肾组织caspase-3、caspase-9蛋白表达的影响 免疫组化结果显示，caspase-3在正常肺组织中有少量表达，照射后24h在支气管黏膜周围表达增强，而在CM 24h组阳性表达减弱；正常肾组织中caspase-3几乎无表达，照射后24h在肾小管中表达增强，而在CM 24h组阳性表达减弱(图1A)。Caspase-9在正常肺组织中几乎无表达，照射后24h在支气管黏膜中表达明显增强，而在CM 24h组阳性表达降低；正常肾组织中，caspase-9几乎无表达，照射后24h在肾小管中表达增强，而在CM 24h组阳性表达降低(图1B)。在右肺、左肺、左肾组织中，RO 24h组caspase-3蛋白表达量明显升高，与NC组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；CM 24h组caspase-3蛋白表达量明显低于RO 24h组，差异有统计学意义(P<0.01)，其余时间点组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。Caspase-9与caspase-3呈现相同的表达规律(表3)。

1.5 HE染色 将肿瘤组织用10%福尔马林浸泡，包埋后切片，切4 μm薄片。行常规HE染色，观察组织细胞的形态。

3 讨 论

中医学中虽无辐射及辐射旁效应损伤的相关记载，但重离子束的高能、快速、穿透力强、杀伤力大等特性与中医学“毒邪”的致病特点(如致病猛烈、发病急骤、传变迅速、耗伤机体气血阴津等)极为相似[9-11]，故辐射旁效应损伤的中医学病因为毒邪。毒邪直中脏腑、败坏形体、耗伤机体气血阴津，使机体气血两虚，阴津不足，气虚无力推动血行，瘀血内阻，故其病机以气血两虚、阴津不足为主，兼瘀血阻滞。

2.1 归芪益元膏对大鼠肺肾组织caspase-3、caspase-9 mRNA表达的影响 由表2可见，在右肺组织中，caspase-3、caspase-9 mRNA表达量在单纯辐射6、12、24h后均明显升高，与NC组比较差异有统计学意义(P<0.01)；CM 12h、24h组caspase-3 mRNA以及6h、24h组caspase-9 mRNA表达量均明显低于同时间点的RO组，差异有统计学意义(P<0.01)，其余时间点组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。在左肺组织中，单纯辐射6、12、24h后caspase-3、caspase-9 mRNA表达量均明显升高，与NC组比较差异有统计学意义(P<0.01)；CM 24h组caspase-3 mRNA表达量明显低于RO 24h组，CM 12h和24h组caspase-9 mRNA表达量明显低于同时间点的RO组(P<0.01)，其余时间点组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。在左肾组织中，caspase-3、caspase-9 mRNA表达量在单纯辐射6、12、24h后均明显升高，与NC组比较差异有统计学意义(P<0.01)；CM 12h、24h组caspase-3 mRNA表达量明显低于同时间点的RO组，CM 6h、12h和24h组caspase-9 mRNA表达量均明显低于同时间点的RO组(P<0.01)，其余时间点组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

UWB脉冲源经发射天线发射无载频单极冲激脉冲信号，接收机通过接收天线将目标回波信号送至取样变换电路，经时域变换取样得到回波信号。通过对回波信号的处理分析来提取目标的距离方位信息。IR-UWB穿墙雷达回波信号处理流程如图2所示，输入数据为采样得到的回波信号x[m,n]。首先对回波数据进行脉冲积累，由于穿墙探测中信号经过墙体的双程穿透衰减，得到的目标信息较为微弱，需要对脉冲积累后的数据作降噪处理，进一步提高信噪比，最后输出降噪处理后的信号。

Caspase家族蛋白酶在细胞凋亡中居中心地位，是多条凋亡通路的汇聚点，可以直接导致细胞凋亡解体，在凋亡中起着关键的调控作用[12]。其中caspase-9为凋亡起始因子，位于级联反应上游，能在其他蛋白参与下发生自我活化并激活下游的caspase-3；caspase-3是凋亡执行因子，它的激活标志着细胞凋亡进入了不可逆转的阶段[13-14]。

  

图1 各组大鼠肺肾组织中caspase-3和caspase-9蛋白表达比较Fig. 1 The protein expression levels of caspase-3 and caspase-9 in lung and kidney tissues of rats in each group

 

A. Caspase-3 protein; B. Caspase-9 protein; NC. Normal control; RO. Radiation only; CM. Chinese medicine

 

表3 归芪益元膏对大鼠肺肾组织caspase-3和caspase-9蛋白表达的影响(±s，n=6)Tab.3 Effects of Guiqiyiyuan Ointment on the expressions of caspase-3 and caspase-9 in lung and kidney tissues of rats (±s, n=6)

  

NC. Normal control; RO. Radiation only; CM. Chinese medicine; (1)P<0.01 compared with NC group; (2)P<0.01 compared with RO group

 

Group Right lung Left lung Left kidney Caspase-3 Caspase-9 Caspase-3 Caspase-9 Caspase-3 Caspase-9 NC group 91.69±4.27 90.33±2.78 85.65±3.76 90.34±3.63 93.99±2.17 87.74±2.43 RO group 6h 84.94±2.41 88.13±3.36 80.24±4.44 86.82±4.29 88.66±1.90 81.82±3.59 12h 85.04±2.82 86.66±4.04 81.03±3.05 86.92±5.43 88.13±7.97 82.13±3.78 24h 81.35±2.89(1) 83.63±4.52(1) 76.44±5.22(1) 81.92±4.24(1) 84.06±3.95(1) 79.71±2.46(1)CM group 6h 87.13±4.75 88.43±1.68 83.33±2.81 87.80±5.68 90.61±2.50 85.42±3.63 12h 86.31±6.01 86.57±1.60 83.10±7.60 89.26±3.77 91.09±0.73 85.29±4.59 24h 91.86±4.61(2) 92.81±3.51(2) 87.80±2.52(2) 93.33±2.11(2) 95.30±2.20(2) 88.06±3.76(2)

1.8 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以±s表示，采用单因素方差分析进行组间比较，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

综上所述，重离子辐射大鼠右肺部后，左、右肺和左肾组织中存在caspase-3、caspase-9基因表达的异常，归芪益元膏可通过抑制caspase-9、caspase-3表达的上调减轻肺肾细胞凋亡，从而发挥其对重离子辐射诱发体内旁效应损伤的防护作用。

【参考文献】

[1]Liang JQ, Li JT, Li J, et al. Effect of Guiqiyiyuan ointment on bystander effect in rat models of 12C6+ beam radiation damage[J].Med J Chin PLA, 2017, 42(10): 870-875. [梁建庆, 李金田, 李娟, 等. 归芪益元膏对12C6+束辐射损伤模型大鼠旁效应的影响[J]. 解放军医学杂志, 2017, 42(10): 870-875.

鲁迅清醒地意识到，当时中国现代文学与世界文学的一流水准之间相比，还有相当大的差距，而在翻译和介绍国外优秀作品方面，国内也严重滞后，吸收借鉴太少太迟。即以《小约翰》为例，该书是凡·伊登青年时代的作品，发表于1887年，但直至40年后的1927年，才由鲁迅和同事齐寿山联手译成中文，其时凡·伊登已68岁了。

1.5 标本采集 照射后6、12、24h处死各组大鼠，取出右肺、左肺、左肾，冰生理盐水冲洗，一部分以液氮快速冷却后分别放入无酶冻存管，–80℃冻存；另一部分用4%多聚甲醛固定。

A:问题既复杂也很简单：“你需要学会做妈妈”。学什么？怎么和孩子保持良好的互动？怎么和孩子对话？有质量的陪伴的基础就是亲子互动，在互动中，孩子的求知欲获得满足，你随时帮助孩子提高认知，学会思考与表达自己的想法和需求。你孩子没有这些该有的能力，这和你的陪伴质量直接相关。

[4]Lei RH, Zhao T, Wu GS, et al. Bystander effects induced by brain-localized heavy ion radiation in rats[J]. Life Sci Instr,2015, 13(12): 24-30. [雷润宏, 赵拓, 吴国松, 等. 脑局部重离子辐射诱导大鼠外周旁效应研究[J]. 生命科学仪器, 2015,13(12): 24-30.]

4月18日，水利部抗震救灾前方领导小组组长、青海省水利厅抗震救灾前线指挥部总指挥于丛乐厅长、副总指挥张世丰、张伟副厅长分别带领抢险分队深入一线，详查供水设施、禅古电站安全隐患，巡查巴塘河、扎西科河两岸滑坡淤塞河道情况，研究应急供水和禅古电站水库大坝应急处置方案。

[6]Liang JQ, Li JT, Li J, et al. Bystander effects of Gui qi yi yuan Ointment on lung and kidney of rats damaged by heavy ion radiation[J]. Med J Chin PLA, 2017, 42(8): 674-680. [梁建庆,李金田, 李娟, 等. 归芪益元膏对重离子辐射损伤模型大鼠肺肾旁效应的影响[J]. 解放军医学杂志, 2017, 42(8): 674-680.]

[7]Jia C, Zhang LZ, Xing S, et al. Protective effect of α-tocopherol succinate against early hematopoietic injury in mice with acute radiation sickness[J]. Med J Chin PLA, 2014, 39(4): 333-337.[贾超, 张刘珍, 邢爽, 等. α-生育酚琥珀酸酯对急性放射病小鼠早期造血损伤的防护作用观察[J]. 解放军医学杂志,2014, 39(4): 333-337.]

[5]Li C, Shao S, Tu XM. Effects of Si jun zi Decoction on weight and peripheral hemogram of the radiated mice[J]. Radiat Prot,2015, 35(6): 345-352. [李辰, 邵帅, 涂序珉. 四君子汤对受照小鼠体重及外周血象的影响[J]. 辐射防护, 2015, 35(6): 345-352.]

[3]Najafi M, Fardid R, Hadadi G, et al. The mechanisms of radiation-induced bystander effect[J]. J Biomed Phys Eng, 2014,15(4): 163-166.

[8]Cheng GP. Medical insight[M]. Beijing: People's Medical Publishing House, 2006: 187-188.[程国彭. 医学心悟[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2006: 187-188.]

[9]Gao MZ, Xu WH, Wang TQ, et al. Exploration of Chinese medicine etiology of acute radiation injury[J]. J Tradit Chin Med, 2016, 57(6): 454-457. [高明泽, 徐文慧, 王天琪, 等. 急性辐射损伤的中医病因学探讨[J]. 中医杂志, 2016, 57(6):454-457.]

[10]Di WYC, Li NJ. Discussion on evolution and Yin and Yang nature of the conception of Du in traditional Chinese medicine[J].Chin J Tradit Chin Med Pharm, 2010, 25(5): 654-657. [第五永长, 李妮矫. 论中医“毒”概念的演变及其阴阳属性[J]. 中华中医药杂志, 2010, 25(5): 654-657.]

[11]Zhang R, Luo B, Li F. Discussion on Chinese medicine pathology of ionizing radiation damage based on toxic factors[J]. J Beijing Univ Tradit Chin Med, 2007, 30(9): 595-597. [张蓉, 骆斌, 李峰. 从毒邪致病论电离辐射损伤的中医病机[J]. 北京中医药大学学报, 2007, 30(9): 595-597.]

式中，ADD1、ADD2、ADD3分别为经口-作物、口-土壤、皮肤-土壤途径的化学物质日平均暴露剂量，mg·kg-1·d-1；其他参数定义和取值见表 2，取值参考环境保护部发布的《污染场地风险评估技术导则》（HJ 25.3—2014）。

[12]Tong DM, Sun FJ, Sun LQ, et al. Effects of gravitational traction and targeted regulation of caspase3 on the degenerative intervertebral disc cells in rabbits[J]. Med J Chin PLA, 2017,42(12): 1072-1077. [佟德民, 孙凤杰, 孙利群, 等. 自体垂直悬吊牵引与靶向调控caspase3对兔退变椎间盘细胞的影响[J].解放军医学杂志, 2017, 42(12): 1072-1077.]

[13]Morgan CW, Julien O, Unger EK, et al. Turning on caspases with genetics and small molecules[J]. Methods Enzymol, 2014,544(3): 179–213.

根据“人事相宜促进”规律可知，人力资源开发中将适当的人放在适当在岗位上极为重要，有利于员工自主能动性的发挥与才能的增长。对此事业单位必须坚持按事设岗，完善相关岗位管理工作，严格根据单位发展目标设置相应的岗位、招聘人员，对每个岗位的性质、工作内容、职责、薪酬福利等等均要有一个明确的规定，切实保证公开招聘、内部竞聘的公平、公正、公开，严禁出现随意变更岗位任职条件、因人设岗问题的出现。

[14]Romero A, Calvar NE, Dios S, et al. New insights into the apoptotic process in Mollusks: characterization of caspase genes in Mytilus galloprovincialis[J]. PLoS One, 2011, 6(2): e17003.