瓜氨酸对脓毒症大鼠肠道的保护作用及高迁移率族蛋白B1释放水平影响的研究＊

脓毒症是一种由感染导致的机体反应对机体本身和器官组织造成损害而导致的致命性疾病，新的脓毒症定义更加明确地强调紊乱的宿主反应和严重的致死性器官功能障碍是脓毒症区别于其他感染的主要元素［1］。1973 年，高迁移率蛋白（high mobility group protein，HMG）首次被提取并鉴定，由于它们在聚丙烯酰胺凝胶电泳中拥有较高的迁移能力，故而得名［2］。 HMG 家族包括了 HMGA、HMGB 和 HMGN三个亚族，在真核生物的细胞中普遍存在；HMGB家族中又有三种蛋白，分别是HMGB1、HMGB2以及HMGB3［3］。1999 年，Wang等首先证实了 HMGB1 是小鼠体内发挥生物学作用的晚期炎症因子［4］，此后HMGB1便逐渐成为重症脓毒症相关的一个研究方向［5］。白介素 1（interleukin 1，IL1）、白介素 6（interleukin 6，IL6）和肿瘤坏死因子（tumor Necrosis Factor，TNF）等为早期炎症因子，其半衰期较短、在炎症发生后的短时间内即大量释放并发挥作用［6］，而HMGB1等晚期炎症因子则在疾病进展了一段时间后才得以大量释放且持续释放时间较长，故它们或具有相对更高的临床检测价值，针对晚期炎症因子的干预或有望成为治疗脓毒症的一个新方向。

仿真结果表明，随着外加负载的增加，活塞的运动速度也有一定程度的降低。但是相比泄漏模型，此模型仿真结果中发现，在相同的外加负载增加时，速度降低的幅度要小。分析可能是因为随着负载的增加，泄漏模块中的泄漏量增加，致使活塞的速度下降幅度增加。

瓜氨酸是一种非存在于蛋白质中的L-a-氨基酸，我们的前期研究［7］发现瓜氨酸可有效地延缓脓毒症大鼠早期炎症因子的释放，并可以提升机体后期抗炎细胞因子的释放水平，一定程度上降低了大鼠的脓毒症严重程度。本实验采用大鼠盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）模型，通过灌胃给药外源性瓜氨酸，对脓毒症大鼠结肠组织病理改变以及HMGB1表达水平的影响进行研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 CLP造模选择无特定病原体（specified pathogen free，SPF）等级、（300.00±50.00） g、8～10周龄健康雄性SD大鼠140只。大鼠先于广西医科大学SPF级动物房饲养1 w以适应新环境。室温控制在25℃左右，空气湿度控制在50%左右，每日光照12 h模拟正常昼夜节律，大鼠皆自由饮食。

随着日军在南京屠城、强奸的事件渐渐被揭示，渐渐显出它的规模，我姨妈对赵玉墨的追寻更是锲而不舍。她认为她自己的一生都被一九三七年十二月的七天改变了。她告诉我，她和同学们常常冒出窑姐们的口头禅，或冒出她们唱的小调，那些脏兮兮的充满活力的小调居然被学生们学过来了，全是下意识的。偶然争吵起来，她们也不再是曾经的女孩，变得粗野，个个不饶人，你嘴脏我比你还脏，一旦破了忌讳，她们觉得原来也没什么了不起，男人女人不就那一桩事?谁还不拉不撒?到了想解恨的时候，没有哪种语言比窑姐们的语言更解恨了。那之后的几个月，法比·阿多那多费了天大的劲，也没能彻底把她们还原成原先的唱诗班女孩。

1.6 血清HMGB1水平检测 血液样本于常温下静置2 h后以3000 g转速离心15 min，分离出上清液并转移至EP管内，即为血清。将血清分装后立即冻存于-80℃冰箱中。检测前取各组冻存血清样本放置于4℃冰箱解冻，HMGB1水平使用武汉华美ELISA 试剂盒（LOT：Q22013238）检测，绘制标准曲线计算样本浓度。大鼠HMGB1水平正常参考范围0～200 pg/mL。

1.4 生存率情况 造模后，每次取样前观察该取样组大鼠生存状态，并记录相应时间点各组大鼠生存率。

1.3 CLP手术操作及造模结果判断 （1）CLP手术前12 h对大鼠进行禁食，术前6 h进行禁饮。CLP手术操作主要参考 Wen［8］和 Siempos II［9］等文献报告。具体步骤如下：（1）每只大鼠称量后按0.30 mL/100 g的剂量为大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉；（2）编号并备皮后用组织剪于腹部正中剪开长度约1.5 cm的纵行切口；（3）打开腹腔后，用镊子小心夹出盲肠，放置于预先盖在大鼠腹部的用生理盐水湿润过的无菌小方纱上；（4）将盲肠内容物用手轻轻挤压至盲肠游离末端，以确保结扎穿孔段肠管内有足够内容物，并取4.0号缝线在盲肠中段部位结扎；（5）用21G针头贯穿被结扎段盲肠的中间部分，移去针头后适当挤压结扎段肠管，使部分肠内容物通过穿刺后留下的孔道流出，小心地将盲肠从切口处回纳入腹腔，并尽量不要触碰到切口以免切口感染，这些外流的肠内容物将是引起大鼠脓毒症发生的诱因；（6）使用4.0号缝线间断缝合手术切口；（7）以4 mL/100g的剂量皮下注射温热生理盐水，并用电烤灯供暖直至大鼠苏醒。苏醒后的大鼠送回动物房内继续常规饲养。（8）脓毒症大鼠模型造模是否成功参考Wen［8］的文献报告。

1.5 实验样本采集及处理 （1）取样选择：Normal组和Sham组在术后24 h取样；CLP组与CLP+Cit组在造模之后的 6 h、12 h、24 h、48 h四个时间点分别在对应亚组存活的大鼠中各随机选取8只取样，如存活数量不满8只则全部取样。（2）样本采集及处理：取样时先沿着原切口打开麻醉后的大鼠腹腔，在尽量避免切口大量出血的情况下观察腹腔内大致的病变情况，再扩大切口，用湿润小方纱小心钝性分离出腹主动脉，使用28G采血针以约30°斜刺入腹主动脉后立即接上5 mL真空采血管（红管），收集约5 mL动脉血。采血完成后用血管夹夹闭动脉近心端，找到结肠并剪去肠系膜分离出一段肠管，剪下约1 cm结肠肠管，在生理盐水中洗净后放入装有福尔马林溶液的EP管中固定。大鼠结肠组织在室温下固定24 h后做石蜡包埋，切片后做HE染色，显微镜下观察比较各组大鼠结肠组织的病理改变。

1.2 模型分组 设正常组（Normal组）、假手术组（Sham 组）、CLP 手术的给药组（CLP+Cit组）和未给药组（CLP组）四组。Normal组大鼠不做任何特殊处理；Sham组大鼠行假手术，即腹腔注射水合氯醛麻醉后打开大鼠腹腔，轻微翻动盲肠附近肠管后立刻缝合切口，不行CLP术；CLP组大鼠进行CLP手术；CLP+Cit组大鼠需在CLP手术前使用L-瓜氨酸按200 mg/（kg·d）的剂量连续灌胃给药 1 w。 Normal组和Sham组每组准备8只大鼠。由于HMGB1主要在脓毒症发生后约24～48 h达到峰值，故对CLP+Cit组和CLP组两组大鼠按术后取样的时间点分别各设 6 h（10 只）、12 h（12 只）、24 h（16 只）、48 h（24只）四个亚组。各组中的大鼠皆按随机分配入组，每组大鼠数量根据课题组前期实验经验预估每组死亡率得出，以确保每组大鼠都能取6～8只存活样本。

2.3 大鼠结肠组织病理观察 各组大鼠结肠组织HE染色后在100倍光镜下可见：（1）Normal组大鼠结肠组织结构完整，无水肿，无炎症细胞浸润，见图5；（2）Sham组大鼠结肠组织有轻微水肿，几乎无炎症细胞浸润，见图6；（3）CLP组 24 h大鼠结肠组织有大量炎症细胞浸润，结肠组织水肿，见图7；（4）CLP+Cit组24 h大鼠结肠组织有炎性细胞浸润但程度轻于 CLP组，结肠组织水肿明显，见图8。CLP组与CLP+Cit组大鼠的结肠病理切片在40倍镜下比较，可见CLP组的大鼠结肠组织炎症细胞浸润程度明显重于CLP+Cit组，两组均可见组织水肿，见图9及图10。

2 结 果

在该人行天桥建设中，在桥梁顶面需要设置透明雨棚，避免行人行走时受到雨水影响。雨棚选用轻质透明PC耐力板，不仅柔软度比较高，而且更加美观。在桥梁排水方面，主桥采用纵坡自然排水方式。

2.1 大鼠一般状态 在各取样时间点观察大鼠的一般状态与存活情况。（1）Normal组和Sham组的大鼠精神状态良好，饮食排便状况无异常，被毛柔顺，且在造模后24 h取样前无死亡，生存率皆为100%。（2）两组CLP手术大鼠在造模后逐渐出现精神萎靡、活动减少、竖毛等情况，部分大鼠出现排稀便、血便的情况。24 h时CLP组大鼠打开腹腔后可见大量血性腹水，肠管肿胀扩张，结扎处附近肠段部分坏死，盲肠周围内脏多有严重粘连，见图1及图3，造模成功［8］；而相同时间点的CLP+Cit组大鼠则腹水较少且多无血性，肠管水肿坏死情况以及内脏粘连情况也较CLP组更轻，见图2及图4。48 h时两组打开腹腔后可见大体差异较24 h小。

2.2 大鼠生存率 CLP组与CLP+Cit组大鼠在6 h生存率均为100%。两组在12 h、24 h、48 h四个时点的生存率差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

  

图1 CLP组24 h腹腔积液

  

图2 CLP+Cit组24 h腹腔积液

  

图3 CLP组24 h腹腔器官

  

图4 CLP+Cit组24h腹腔器官

 

表1 CLP与CLP+Cit组大鼠各检测时点生存率比较［n（%）］

  

组别 6 h 12 h 24 h 48 h CLP 10（100.00） 10（83.33） 12（75.00） 12（50.00）CLP+Cit 10（100.00） 11（91.67） 14（87.50） 18（75.00）χ2 - 0.381 0.821 3.200 P-0.537 0.365 0.074

1.7 统计学方法 使用SPSS 17.0进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用（）形式描述，组间比较采用t检验，符合偏态分布的计量资料采用中位数（P25，P75）表示；计数资料采用［n（%）］表示，组间比较行χ2检验。以双侧Ρ＜0.05为差异有统计学意义。

  

图5 Normal组结肠组织（HE×100）

  

图6 Sham 组结肠组织（HE×100）

  

图7 CLP组 24 h结肠组织（HE×100）

  

图8 CLP+Cit组 24 h结肠组织（HE×100）

  

图9 CLP组 24 h结肠组织（HE×40）

  

图10 CLP+Cit组 24 h结肠组织（HE×40）

 

表2 CLP与CLP+Cit组大鼠血清HMGB1水平（pg/mL，）

  

组别 6 h 12 h 24 h 48 h CLP 842.21±229.45 1513.09±303.71 2751.91±630.43 872.37±378.85 CLP+Cit 921.66±156.01 955.36±199.43 1489.30±254.69 298.47±149.30 t-0.810 -4.132 -5.252 3.986 P 0.432 0.001 0.000 0.001

精氨酸是一种双基氨基酸，在机体发生应激反应或创伤修复时发挥作用，在细胞再生、伤口愈合、免疫功能、蛋白质转化等方面均有重要作用，并参与维持机体正氮平衡与正常的生理功能，有效提升机体的耐受力，但血浆及肌肉中的精氨酸水平会在脓毒症发生时显著降低［10］。 此外，Lortie 等［11］的研究表明，发生脓毒症时直接给患者补充精氨酸并没有明显的缓解效果，在动物实验［12］中还发现直接使用精氨酸给药会显著加重脓毒症大鼠的脓毒性休克情况，增加死亡率，其原因在于体内过量的精氨酸会与iNOS反应产生多余的NO，而NO会损害心血管系统，出现组织供氧不足等症状，从而进一步加重病情的发展［13］。

3 讨 论

2.4 大鼠血清HMGB1水平 Normal组和Sham组HMGB1实测值均在正常值参考范围内，Normal组平均水平为 21.39 （0，25.08）pg/mL，Sham 组平均水平为78.25（0，100.33）pg/mL。在进行检测的四个时点中，CLP组与CLP+Cit组HMGB1水平均在24 h测得最高值，且在12 h、24 h、48 h三个时点上两组HMGB1水平差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

超磁透析保护及原位生态修复技术是四川环能德美股份有限公司提出的一种全新的湖泊和城市河道等景观水体污染治理的方法。超磁透析技术可以高效去除水体中悬浮物、磷、藻类和非溶解性COD，大幅度改善水体的透明度，快速削减富营养盐，恢复景观水质；再与原位生态修复技术相结合，使河湖水生态系统的功能得到有效恢复。根据技术的特点，可在水污染应急处理、河流水质净化处理、河流“双提”工程（提水位、提水质、促流动）、湖泊水体透析净化、生态湿地公园水质改善与保持等五个领域得到广泛应用。

瓜氨酸是一种特殊的氨基酸，并不存在于蛋白质中。瓜氨酸在细胞中参与精氨酸合成NO的内循环过程，该内循环即为“瓜氨酸-一氧化氮循环（Cit-NO cycle）”，由于该循环为可逆反应，存在负反馈调节，因此与精氨酸结构相似的瓜氨酸作为合成精氨酸的前体，不仅能促进精氨酸进入细胞内并提升精氨酸的作用，还可以竞争性地抑制酶活性中心，对NO生成进行负反馈调节，从而有效维持细胞内精氨酸和NO水平的相对稳定，确保反应的持续性［14-15］。此外，瓜氨酸还对心血管系统具有一定的调节作用，包括扩血管、降血压等［16］。因此相对于精氨酸，瓜氨酸或在治疗脓毒症的临床应用中可发挥更大的效用。

到了第三阶段，随着“社会养老服务”的概念正式出现在官方话语中并从此成为我国养老事业的核心概念，对于“社会”的用法更加清晰、逐渐定型。将“社会养老为补充”更改为“机构为支撑”，这标志着将“社会养老”不再简单等同于“机构养老”。“社会养老服务体系”主要由居家养老、社区养老和机构养老等三个有机部分组成，那么就是说“居家”“社区”和“机构”都属于社会的范畴，至此“社会”狭隘的地点性含义彻底被摒弃，这使得“社会”概念有了回归其本身广泛内涵的可能性。

脓毒症可以导致炎症介质的大量释放以及免疫功能混乱，大部分早期炎症介质半衰期短且临床上不易检测到其峰值，因此其拮抗剂在临床应用中的作用并不显著［6］。而如HMGB1这样的晚期炎症介质则表达得比较晚且半衰期较长，更为有利于临床上观察和针对性治疗，在临床治疗中的前景或较大。HMGB1是脓毒症时关键的晚期炎症因子，也是导致脓毒症时肠道黏膜层破坏的重要因素之一。Sappington 等［17］的研 究表 明，HMGB1 在脓毒症发展过程中可以促使肠道黏膜屏障功能被破坏，而减少HMGB1在体内的水平，可以显著减轻肠道屏障功能被破坏的程度。

我们的前期研究发现，补充外源性瓜氨酸对脓毒症大鼠的肝脏、心脏都有保护作用［7,18］，这可能与瓜氨酸对脓毒症大鼠体内多种炎症因子有调节能力并能提高脏器组织的抗氧化能力有关。本次研究发现，瓜氨酸灌胃给药能有效地减轻大鼠脓毒症症状，减缓脓毒症的发展速度，提示补充外源性瓜氨酸能有效控制脓毒症时期大鼠体内的炎症反应。此外，瓜氨酸还有降低脓毒症时期的关键晚期炎症因子HMGB1的作用，并对大鼠肠道组织的炎症细胞浸润有良好的抑制作用，可较为显著减轻大鼠肠道的炎症反应，保护大鼠的肠道，或因瓜氨酸抑制了HMGB1的表达，从而降低了肠道黏膜的损害、减轻了肠道组织的炎症反应。除此之外，血清中HMGB1含量的降低也一定程度上减轻了脓毒症导致的全身炎症反应，配合瓜氨酸对其他炎症因子的调控［7］，可对处于脓毒症时期的机体和体内各器官起到了一定的保护作用。两组CLP大鼠在各个时点的生存率并不存在差异，而本次研究数据仅基于各时点实测值，故未能进一步分析累积生存率，为本研究不足之处。

基于本研究可认为，补充外源性瓜氨酸可有效缓解大鼠的脓毒症症状，降低大鼠结肠组织炎症反应，对脓毒症时期的结肠起到了保护作用，同时也显著降低了血清中晚期炎症因子HMGB1的水平。

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