不同酒曲生料液态酿酒比较及优势真菌分离鉴定

中国白酒历史悠久，固态、开放式发酵窖池的自然发酵传统酿造工艺在中华老字号酿酒厂传承至今。而传统生产工艺复杂，生产占地面积大，出酒率低、酿造时间长，食品生产环境清洁度、自动化程度低，工业化生产程度不高。液态法生料酿酒是基于我国传统酿酒工艺，以粮食为原料加入酒曲和水，糖化发酵蒸馏而成，是当代先进的酿酒技术。区别于传统工艺，液态法生料酿酒过程中，原料不经过蒸煮糊化，采用密闭不锈钢发酵罐酿酒，具有自动化程度高、原料利用率高、生产关键点可控、出酒率高及能耗低等优点。新型、高效、节能酿酒工艺的开发及建立，对实现市场发展需求具有重要意义。

目前，随着分子生物学技术及测序技术的快速发展，菌种鉴定方法已经从传统方法逐渐发展到基因水平鉴定，两种方法的结合可快速、准确地分离鉴定酒曲中微生物，获得的微生物可在白酒的生产或者生物制药其他产品中单独或复合应用。本实验以高粱面、大米面、玉米面等为原料，研究不同酒曲对液体生料发酵技术的影响，建立最优液体发酵工艺。并对清香型酒曲中主要真菌进行分离鉴定，为后续研究提供新型菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高粱面，淀粉含量约为65.0%，市售；玉米面，淀粉含量约为72.6%，市售；大米面，淀粉含量约为76.0%，市售。安琪酿酒曲(配料表：酵母、根霉、α-淀粉酶，葡萄淀粉酶、植物酶)，市售；清香白酒酒曲，酒厂厂家提供。

酵母基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；Ex Taq DNA聚合酶，大连宝生物生物技术有限公司。

在新课改不断推进的背景下，班主任要有反思意识，加强理论学习，如果班主任管理拖了后退，那我们难以享受到新课改的成果。

1.2 仪器与设备

YT-CJ-2ND型超净工作台，北京陆希科技有限公司；LRH-150F生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；SKY-1102C，上海苏坤实业有限公司；HWS-24型恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；MLS-3781-PC型高压蒸汽灭菌锅，日本松下公司；5804R型离心机，德国Eppendorf公司；Veriti 96-Well型PCR仪，美国ABI公司；ChampGel 5000凝胶成像仪，北京赛智创业科技有限公司；MC酒精计，河北省武强县同辉仪表厂；DMB5型Motic数码显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司。

四种施工方法管片均整体向下位移，离区间隧道较近的底部管片变形略大于其他部位，台阶法施工管片最大变形为11.2 mm，CRD法施工为6.8 mm，临时仰拱台阶法和CD法施工结果较接近，分别为8.8 mm和9.1 mm。对临时仰拱台阶法施工盾构管片沿环向变形(见图11和图12)分析，结果表明，管片最大变形在地铁区间拱顶上方，而不是两隧道中心截面，且管片在地铁双区间截面中心±15 m范围内变形均较大，量值在8 mm～9.5 mm之间，因此为减小变形，可着重对这30 m段管片局部加固。

1.3 方法

1.3.1 培养基的制备

实验中对平板中菌落进行镜检，共有5个菌落具有酵母菌特性形态，培养基上为边缘整齐、表面平坦、光泽的乳白色菌落。对菌落进行多次划线纯化，获得单一菌株。提取单一菌株的DNA，进行PCR扩增，对得到的800 bp左右长度序列(见图1)。进行测序后，将测序结果在NCBI数据库Gen Bank中进行BLAST比对，Saccharomyces cerevisiae C01与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)同源(同源性为99%)，建立系统发育树如图2所示。

(2) CYM固体培养基的配制：20 g葡萄糖，2 g胰蛋白胨，2 g酵母膏，0.5 g七水硫酸镁，1.0 g磷酸氢二钾，0.46 g磷酸二氢钾，20 g琼脂加水配制成1 L，分装，121 ℃蒸汽灭菌20 min。降温后，倒入已灭菌的90 mm直径的培养皿中，待培养基完全凝集后，放置在4 ℃的冰箱中保存。

(3) 斜面培养基的配制：20 g葡萄糖，2 g胰蛋白胨，2 g酵母膏，0.5 g七水硫酸镁，1.0 g磷酸氢二钾，0.46 g磷酸二氢钾，加水配制成1 L。将培养基倒入试管，121 ℃蒸汽灭菌20 min。灭菌后，倾斜放置试管待培养基完全凝集，放置在4 ℃的冰箱保存。

[2]刘森.PCR聚合酶链反应[M].北京:化学工业出版社,2009.

学生的阶段性学习成绩不好时，会说：老师，对不起，下次努力来安慰教师。学生为成绩突飞猛进而高兴。教学中，很多学生获得了成功。学生掌握的知识点上升到85%左右，甚至达到90%。通过一定的心理暗示，取得了良好的教学效果。

由于重量系统是滞后控制，故不能完全消除质量不合格烟支，所以需要实时计算每支烟的重量，并判断是否在重量允许范围内，对不合格烟支进行剔除，可有效控制平均重量和标准偏差。同时根据烟支重量分布情况，可判断出烟支是否存在空松、结块等故障，并将其剔除以提高成品烟品质。

关于慧览到达罽宾求法以及离开于阗的具体时间，《高僧传》没有明确记载。唐长孺先生根据《名僧传抄》考证，慧览到达罽宾是在元嘉四年（427）之后，他由于阗东返吐谷浑的时间在元嘉十七年至二十一年，即公元440年至444年之间③唐长孺：《南北朝期间西域与南朝的陆道交通》，载氏著《魏晋南北朝史论拾遗》，中华书局，1983年，第184-185页。。以此类推，慧览在巴蜀和岭南罗浮山的时间，应该在元嘉十七年至元嘉三十年之间，即公元440年至453年之间。他在罗浮山究竟待了多久，待了几年，依据现有资料，还不能得出结论。

1.3.3 菌种的鉴定

这时，猴子跑进来说：“县里来电话，说新站长乘下午一点的班车到。”我一看表，是十二点三十六分，得赶紧准备。

使用TIANGEN公司的酵母基因组DNA提取试剂盒进行提取，使用ITS通用引物对DNA进行PCR扩增。

偏析带的存在与原材料有关，偏析区与正常基体不协调形变导致偏析带产生孔隙，孔隙扩展为裂纹后，逐渐沿周边向外扩展即造成线材断裂。

50 μL PCR扩增体系：1 μL模板DNA、5 μL PCR缓冲液(不含MgCl2)、5 μL 10×MgCl2溶液、4 μL dNTP(2.5 mmol/L)、2 μL上游引物(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG，50 μmol/L)、2 μL 下游引物(TCCTCCGCTTATTGATATGC，50 μmol/L)、0.5 μL Taq DNA 聚合酶，无菌去离子水加至50 μL。

参考文献：

反应程序为：95 ℃变性2-5 min、94 ℃变性30-60 s、50 ℃-70 ℃退火1-2 min、30-40个循环后，于72 ℃延伸10 min。PCR产物在生工公司测序，测序结果使用Seqman软件进行拼接校对，最终的序列结果在NCBI数据库Gen Bank中进行BLAST比对[2-4]。

1.3.4 液态酿酒工艺

大米面、玉米面和高粱面按1∶1∶3的比例混合，同时以1∶4的料水比加水混匀原料，拌至面粉结块消失。将安琪酒曲、清香白酒酒曲和自制混合酒曲(安琪酒曲50%和清香白酒酒曲50%)以0.8%、1.2%和0.7%的添加量分别加入三份料液中搅拌均匀(分别标记为A组、B组和C组)，放置培养箱28 ℃发酵21 d。每24 h定时搅拌，将沉淀物搅散，观察现象。将完成发酵的酒液倒入蒸镏锅中进行蒸馏，按照出酒顺序将酒液分瓶接取，用酒精计测量整个蒸馏过程中所产酒液的酒精含量变化并进行记录[5]。酿酒流程如下：

→→→→

1.3.5 酒精度的测定

将清香型酒曲进行梯度稀释，将适宜的稀释梯度在CYM固体培养基上划板，28 ℃恒温48 h。培养皿中长起菌落后，对菌落进行镜检，按照菌落形态不同，对菌落进行标记，划线纯化培养[1]。随每24 h对上一代菌种进行纯化，获得单一菌落。

参照GB/T 10345-2007 白酒分析方法中酒精计法，测定酿得白酒的酒精度。

2 结果与分析

2.1 不同酒曲酿酒结果

3．丹池“祷雨甚灵”。王罕岭有一地名叫龙潭岗，根据当地教师袁伯初先生的调查考证，龙潭岗即古丹池山。现依然健在的王右军后裔王翼中先生说：“抗日战争时期，我跟叔父从家里(龙皇堂村)到孙家田村走亲戚，为了躲避驻守沙溪据点的日本佬盘查，绕道王罕岭，路过龙潭岗时，叔父告诉我：‘这是祖上羲之的墨池，王羲之的像已被华堂金庭观抬去。’当时，墨池旁有两个殿，一个龙皇殿，屋有三间，右边殿上挂着一块扇形的匾，匾上书正楷‘丹池’两字；另一个是羲之殿，屋一间，内只剩一个像座。”现尚存的丹池遗址，当地村民依旧称为龙潭，一遇干旱，老人们就会去那里烧香求雨。

表1 不同酒曲液态酿酒结果

组别粮食用量/kg产酒量/kg酒精度%vol外观气味口味A组12.502.98±0.2564清净如水,没有明显悬浮颗粒与杂质沉淀,有明显的挂杯现象具有乙酸乙酯为主体的复合香气酒体较柔和,绵甜甘爽,有余味B组12.5000………C组12.505.60±0.0053清净如水,没有明显悬浮颗粒与杂质沉淀,有明显的挂杯现象具有乙酸乙酯为主体的复合香气酒体较柔和,绵甜甘爽,有余味

注：出酒率指原料对 65 %vol 白酒的出酒率。

2.2 清香型酒曲中主要微生物的分离和鉴定

将酒曲稀释涂布到CYM培养基上，对菌落形态特点初步筛选纯化，得到单一菌株。提取菌株DNA，采用ITS引物(5′端为GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG，3′端为TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行PCR扩增，利用分子生物学手段鉴定菌株。

2.2.1 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)

(1) CYM液体培养基的配制：20 g葡萄糖，2 g胰蛋白胨，2 g酵母膏，0.5 g七水硫酸镁，1.0 g磷酸氢二钾，0.46 g磷酸二氢钾，加水配制成1 L，分装，121 ℃蒸汽灭菌20 min，降至室温后，放置在4 ℃的冰箱中保存。

2.2.2 伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)

观察涂布平板上的菌落特征，挑取菌落形态为霉菌的菌落，对菌落进行多次划线纯化，获得单一菌株。提取单一菌株DNA，对PCR产物(见图3)进行测序，并将测序结果在NCBI数据库Gen Bank中进行BLAST比对。分离的霉菌与Lichtheimia corymbifera同源(同源性为99%)，并命名为Lichtheimia corymbifera B03，建立系统发育树如图4所示。

图1 酵母DNA PCR的凝胶电泳图

图2 Saccharomyces cerevisiae C01的系统发育树

图3 霉菌PCR的凝胶电泳图 A、B、C和D分别为筛选的霉菌PCR条带；E为水

图4 Lichtheimia corymbifera B03的系统发育树

3 讨论与结论

酒曲是经过生料制曲、自然接种、室内固态发酵而成。一般浓香型酒为中温制曲，而酱香型酒为高温制曲，制曲工艺影响酒曲微生物区系和酶系的形成和功能的发挥。李祖明等[6]对红星酒曲、牛栏山酒曲、皇台酒曲和德山大曲酒曲进行了比较，认为适宜酶量是酿酒的动力和发酵的基础，若酶量不足，发酵没有后劲，影响酒精生成；酶量过量，既不经济，也会带来诸多不利影响[7]。白酒酿造是多种菌群的混合发酵，酒曲中主要有酵母，霉菌和细菌三大类微生物。霉菌产生糖化酶和液化酶(如淀粉酶和蛋白酶)进行糖化作用分解原料，提高原料利用率。乔晓梅等[8]利用454焦磷酸测序技术对清香大曲中微生物群落结构进行分析，发现大曲中主要霉菌有米根霉(Rhizopus oryzae)和伞枝犁头霉(Lichtheimia corymbifera)。Lichtheimia corymbifera多分离自酒曲样品中，是一种毛霉目梨头霉属的丝状真菌[9]。在不同选育培养条件下，Lichtheimia corymbifera能够产生淀粉分解酶[10]，也可以发酵生产α-酮戊二酸[9]。酒曲中的酵母菌主要利用糖进行酒精发酵，大多数酵母属于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、清

酒酵母(Saccharomyces sake)及其变种[11]，其中，Saccharomyces cerevisiae具有生长旺盛、生物量大和较高的生物安全性等优点，广泛应用于食品、医药、能源等领域[12]。在清香型酒曲中分离鉴定得到Lichtheimia corymbifera和Saccharomyces cerevisiae，后续研究也将进一步探究这两株分离菌株的自身特性和工业特性，为现代工业化酿造液态发酵生物复合菌剂的构建做好菌种资源的储备。

利用三种酒曲(清香型酒曲、安琪酒曲及自制混合酒曲)进行生料液态酿酒，以自制混合酒曲酿制白酒的产酒量最高，酿酒成本降低，而且得到的白酒酒体柔和、酒味纯正、绵甜甘爽。研究中从清香型酒曲中分离鉴定得到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)两个菌株，为后续白酒相关研究提供了菌种资源。

在新闻语体中，新闻报道要做到真实客观，在修辞表达时就必须要做到表意准确严密，在时间、地点、人物、事件等的叙述方面就不能出现硬伤，不许弄虚作假，不许模模糊糊，不许模棱两可。黎运汉、盛永生认为，准确性是新闻语体的首要要求和基本特点。要做到表意准确，就必须在遣词造句、相关数据的使用、模糊语言的使用、引语的使用等方面下足功夫，做到准确可靠。[2]179-182例如：

[1]高玉妹,陶能国,刘跃进,等.白酒酒曲中9株酵母菌的分离与特性研究[J].食品工业科技,2010(5):195-198.

1.3.2 酒中微生物的分离

[3]王海燕.PCR-DGGE技术对清香型汾酒微生物群落结构演变规律的研究[D].无锡:江南大学,2014.

不同酒曲液态发酵得到的白酒产酒量有明显差异，结果见表1。 A组得到白酒产酒量平均为2.98 kg，产出的酒精度数为64%，B组中没有蒸馏出白酒，C组中产酒量为5.60 kg，且酒精度数为53%。B组使用清香白酒酒曲发酵21 d进行蒸馏时，无白酒蒸出。可能由于利用清香白酒酒曲酿酒时，酶系主要由酒曲中的霉菌代谢产生。液体发酵过程中，由于发酵条件的改变，清香型酒曲在液态发酵14天时才有酸味产生，发酵时间慢，严重影响了产酒量，这一结论表明了清香型酒曲主要适用于白酒固态发酵方式。而A组和C组发酵情况较好，A组中使用安琪酒曲发酵，酒曲中主要含有酵母、根霉、α-淀粉酶，葡萄淀粉酶、植物酶，直接的酶系，加快了酿酒速度，提高了产酒率，得到的白酒产酒量平均为2.98 kg，产出的酒精度数为64%。自制混合酒曲产酒量为5.60 kg，且酒精度数为53%。自制混合酒曲按安琪酒曲和清香型酒曲1∶1混合，由于含有的直接酶系和清香型酒曲中的复杂微生物，经过液态发酵，得到的酒量更高，比安琪酒曲提高了17.75%。而且自制混合酒曲酿得的白酒澄清、口感绵柔，增加了白酒产量，降低了酿酒成本。

[4]奥斯伯F M,奥斯伯,布伦特,等.精编分子生物学实验指南[M].北京:北京大学出版社,2008.

[5]孔繁虎.液态法清香型白酒生产新工艺[J].适用技术市场,2001(2):43-43.

[6]李祖明,王德良,马美荣,等.不同酒曲酶系与发酵性能的比较研究[J].酿酒科技,2010(1):17-19.

[7]宋玉华.液态生料酿制白酒(酒精)研究技术报告[J].酿酒,1986(4):13-21.

[8]乔晓梅,赵景龙,杜小威,等.高通量测序法对清香大曲真菌群落结构的分析[J].酿酒科技,2015(4):28-31.

[9]闫巧娟,徐忠义,蔡威,等.伞枝犁头霉发酵蔗糖产α-酮戊二酸条件的优化[J].中国农业大学学报,2013,18(4):162-167.

[10]秦臻,蔡素梅,黄钧,等.一株产生淀粉分解酶犁头霉的分离鉴定及其酶学性质[J].微生物学通报,2011,38(5):729-735.

本节分别利用合成数据集和真实数据集测试文中所提出的基于改进Kaczmarz迭代的矩阵补全算法的性能.为了方便描述,将该算法简称为IKMC(Improved Kaczmarz iteration based Matrix Completion)算法.通过与SVT算法[6]、FPCB算法[7]以及MFRK算法[8]进行比较,评测IKMC算法在重构精度、成功重构概率、重构时间等方面的性能.仿真实验使用Matlab软件,每次实验重复运行100次后取平均值作为该项实验的计算结果.

[11]郜希璐.白酒窖泥中酵母菌的分离鉴定及发酵特性研究[D].天津:天津大学,2009:43-46.

[12]付肖蒙,王鹏飞,郝爱丽,等.高耐性酿酒酵母的筛选及其耐受性研究[J].中国酿造,2017,36(10):23-26.

班主任工作是平凡而繁琐的工作，我们只有从点滴做起，从小事做起，因势利导，做到润物细无声。浇灌出一朵朵希望之花，让这些美丽的花朵，盛开在祖国肥沃的土地上。