EB病毒感染患儿淋巴细胞亚群特征和EBV DNA载量分析

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）属疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科，为双链DNA病毒。有文献报道，全世界约有90%的人曾感染过EBV[1]。EBV感染在儿科临床很常见，学龄前期及学龄期儿童多以传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis，IM）为表现。IM的特征是患者有大量的单个核细胞增生，其中主要是EBV特异性CD8+细胞毒性T细胞的增殖、活化[2]。而儿童慢性活动性EB病毒（chronic active Epstein-Barr virus，CAEBV）感染的病情与IM比较，更严重且容易反复，严重者会出现多器官衰竭而导致死亡[3]。有研究发现，T细胞、B细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞等在不同疾病转归的EBV感染患儿中的变化特点不同[4-5]。另据报道，IM患儿血清EBV DNA载量与疾病的严重程度相关[6]，DNA的血清载量分析对于诊断CAEBV感染也非常有意义 [7]。

本研究旨在采用流式细胞术分析IM和CAEBV感染患儿的淋巴细胞表型，并对免疫细胞亚群进行定量检测，分析IM和CAEBV感染患儿免疫状态的特点，又通过检测血清EBV DNA载量了解不同疾病状态下病毒的活动情况，从而为IM与CAEBV感染2种疾病的鉴别诊断提供帮助。

常温彩色沥青混合料的拌和，除拌和温度和拌和时间外，其他工艺参数应符合JTG F40—2004中5.4的规定。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2016年1—12月在上海交通大学医学院附属新华医院诊治且进行过淋巴细胞亚群检测的EBV感染患儿35例，其中IM患儿（IM组）17例（男10例，女7例，年龄1～4岁）、CAEBV患儿（CAEBV组）18例（男15例，女3例，年龄3～14岁）。以同期上海交通大学医学院附属新华医院体检健康儿童15名（男10例，女5例，年龄5～14岁）作为健康对照组。

IM诊断标准：（1）以急性发热、咽峡炎、淋巴结肿大、肝脾大等为主要临床表现；（2）淋巴细胞比例增加（＞50%），异形淋巴细胞比例增加（＞10%）；（3）EBV衣壳抗原（viral-capsid antigen，VCA）免疫球蛋白M（immunoglobulin，IgM）阳性和／或外周血EBV DNA阳性；（4）除外巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）等感染。CAEBV感染的诊断标准参照OKANO等[8]建议的标准：（1）临床表现为持续或复发性IM样症状；（2）异常的EBV VCA抗体和早期抗原（early antigen，EA）抗体滴度升高和/或受累组织及外周血EBV DNA增加；（3）慢性病程无法用其他已知疾病解释。

1.2 方法

IM组EBV VCA IgM阳性15例，阴性2例；EBV VCA IgG阳性16例，阴性1例；EBV DNA均为阳性，载量为3.60（1.50，7.15）×103拷贝/mL。CAEBV组EBV VCA IgM抗体、EBV VCA IgG抗体均阳性14例，EBV VCA IgM抗体阴性而EBV VCA IgG抗体阳性4例；EBV DNA均为阳性，载量为1.25（0.19，2.95）×104拷贝/mL。IM组EBV DNA载量明显低于CAEBV组（P=0.027）。

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1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。数据用中位数（四分位数）[M（P25，P75）]表示，非正态分布资料或等级资料多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用Mann-Whitney U检验。相关性分析采用Spearman相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

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1.2.2 EBV DNA的定量检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测EBV DNA载量，试剂由湖南圣湘基因股份有限公司生产，MX3000实时荧光检测系统购自上海吉泰生物科技有限公司。严格按仪器和试剂说明书进行操作。

2 结果

2.1 IM组与CAEBV组血清EBV抗体与EBV DNA载量比较

1.2.1 各淋巴细胞及其亚群比例的检测 采用FACSC anto型流式细胞分析仪及配套试剂（美国BD公司）测定T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+以及CD19+淋巴细胞和CD56+CD16+NK细胞的比例和计数。

2.2 IM组、CAEBV组和健康对照组淋巴细胞比例和计数的比较

IM组B、NK、CD4+T、CD8+T 4种淋巴细胞亚群呈现不同的变化，CD8+T细胞明显增加，比例和计数的中位数分别为61.50%和517 个/μL，均显著高于健康对照组和CAEBV组（P＜0.05）；B、NK、CD4+T 3种细胞的比例与健康对照组比较均显著降低（P＜0.05），但3种细胞的计数均增加（P＜0.05）。CAEBV组仅NK细胞比例较健康对照组出现明显下降（P＜0.05），其余差异均无统计学意义（P＞0.05）。值得注意的是，CAEBV组与IM组比较，CD4+T细胞的比例升高而计数下降，而CD8+T细胞的比例和计数明显降低，2个组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 IM组、CAEBV组和健康对照组B、NK、CD4+T和CD8+T细胞比例和计数的比较

IM组淋巴细胞比例和计数最高，中位数分别为65.90%和7 610个/μL，CAEBV组淋巴细胞比例的中位数为48.40%，也高于健康对照组（29.71%），而CAEBV组的淋巴细胞计数较健康对照组升高不明显。见表1。

2.4 EBV DNA载量与淋巴细胞亚群的相关性

IM组和CAEBV组EBV DNA载量与淋巴细胞亚群无相关性（P＞0.05）。见表3。

 

表1 健康对照组、IM组和CAEBV组外周血淋巴细胞比例及计数 [M（P25，P75）]

  

注： 与健康对照组比较，*P＜0.05；与IM组比较，#P＜0.05

 

2 640（1 698，3 400）IM组 17 65.90（50.48，69.85）*淋巴细胞计数（个/μL）组别 例数 淋巴细胞比例（%）健康对照组 15 29.71（25.60，34.64）3 300（1 515，5 365）#7 610（4 057，9 645）*CAEBV组 18 48.40（40.20，59.12）*#

 

表2 健康对照组、IM组和CAEBV组外周血B、NK细胞比例及计数 [M（P25，P75）]

  

注：与健康对照组比较，*P＜0.05；与IM组比较，#P＜0.05

 

组别 例数 B细胞比例（%） B细胞计数（个/μL） NK细胞比例（%） NK细胞计数（个/μL）健康对照组 15 10.90（6.98，18.90） 236（123，356） 17.80（11.00，23.00） 400（245，578）IM组 17 5.10（3.20，6.40）* 356（296，1 124）* 6.50（5.30，9.00）* 779（528，1 122）*CAEBV组 18 10.95（4.50，14.60）# 351（149，491） 7.45（5.20，4.40）* 279（75，541）#组别 CD4+T细胞比例（%） CD4+T细胞计数（个/μL） CD8+T细胞比例（%） CD8+T细胞计数（个/μL）健康对照组 35.90（28.70，40.90） 698（498，980） 25.80（19.00，34.90） 552（398，691）IM组 13.90（12.25，17.85）* 1 206（970，2 719）* 61.50（55.90，71.90）* 5 217（4 164，10 195）*CAEBV组 30.20（16.17，42.72） # 915（522，1 047）# 31.95（24.67，46.80）# 681（384，2 263）#

 

表3 EBV DNA载量与淋巴细胞亚群的相关性

  

CD8+T细胞IM组EBV DNA r值 -0.131 -0.088 -0.289 0.037 P值 0.615 0.729 0.216 0.878 CAEBV组EBV DNA r值 -0.170 -0.206 -0.081 0.088 P值 0.474 0.383 0.733 0.712指标 NK细胞 B细胞 CD4+T细胞

3 讨论

EBV被国际癌症研究机构归为I类致癌物质，是一种嗜淋巴细胞的DNA病毒，属疱疹病毒属，具有潜伏和转化的特性[9]。有研究结果显示，EBV感染可导致机体细胞免疫功能的不足和缺乏，可直接引起IM，同时可使T细胞、B细胞、NK细胞具备无限增殖和转化为恶性疾病的能力，并与若干恶性肿瘤的发生有相关性[10-12]。机体感染EBV后，细胞免疫功能可发生紊乱，有研究报道证实，原发性EBV感染的最初靶细胞为B细胞，同时B细胞也成为病毒终生潜伏的场所[13]。B细胞介导了原发性、持续性的EBV感染，感染EBV后能无限增殖。在机体免疫状态正常的情况下，这种增殖的B细胞会刺激T细胞的免疫反应，将感染EBV的B细胞杀灭，从而起到清除病毒的作用。而IM患儿的外周血出现的异形淋巴细胞并不是由病毒复制直接引起的，而是T细胞免疫反应的结果[14]。HOSHINO等[15]曾对急性EBV感染的患儿进行连续抽血检验，结果发现EBV的量与特异性的CD8+细胞毒性T细胞的量密切相关。CD4+/CD8+比值是重要的反映免疫状态的检测指标，其比例的降低与免疫系统损伤的程度相关。IM和CAEBV感染同为EBV感染，但CAEBV感染病情较重且容易反复，预后不良，严重者会导致死亡，且一些CAEBV感染患者有过IM或类似IM症状。因此，临床上早期鉴别诊断IM与CAEBV感染很重要，可提早进行恰当的干预和治疗，防止病情恶化。

EBV抗体测定是诊断IM与CAEBV感染的重要手段。本研究结果显示，大部分EBV感染患儿均出现了EBV抗体的升高，但也有个别病例并未发现抗体水平升高，并且IM患儿和CAEBV感染患儿在抗体表达上难以发现明显差异，抗体滴度的变化仅能作为EBV感染的辅助诊断。本研究结果显示，IM淋巴细胞比例和计数均明显升高，最主要原因是CD8+T细胞的比例和计数大幅上升，而CAEBV组淋巴细胞比例有升高，但CD4+ T细胞及CD8+ T细胞与健康对照组相比变化不显著，B细胞和NK细胞比例和计数也未出现明显降低，这与以往关于成人的文献报道[16]有所不同，原因可能是本研究较早期地对CAEBV感染患儿的淋巴细胞亚群特征进行了监测，患儿的免疫细胞功能还未出现明显下调，另外儿童与成人对于EBV感染的免疫应答可能存在不同之处，尚需进一步研究。本研究中CAEBV组与IM组比较，B细胞计数变化无明显差异，NK细胞降低，与以往文献报道[17]也有所不同，但CD8+T细胞的变化与文献报道[17]一致，进一步证明了IM患者CD8+细胞毒性T细胞的大量增殖导致了病毒的清除，而CAEBV感染患者存在这种免疫反应的缺陷，使病毒无法得到有效清除，临床上表现为病情重且迁延不愈，甚至进一步发展为淋巴瘤或白血病，预后差的结论。本研究同时还分析了2种EBV感染疾病患儿的EBV DNA载量差异，结果显示IM组EBV DNA载量明显低于CAEBV组（P=0.027）。依据本研究的结果，对于临床上早期初诊EBV感染的患儿，如果CD8+T细胞的比例和计数没有大幅上升并且EBV DNA载量又比较高，应警惕其为CAEBV感染患儿，临床上应引起足够重视。由于本研究选择样本为小样本，研究结果还需要进一步验证。尤其对于EBV DNA载量与患儿淋巴细胞亚群特征的相关性还需要大样本数据进一步分析。

综上所述，临床上对于确诊为EBV感染的患儿可以根据淋巴细胞亚群分析和EBV DNA载量测定辅助鉴别诊断IM和CAEBV感染，以便及时调整治疗方案，避免患儿病情加重。

参考文献

[1]MACARTHUR G J，WILSON A D，BIRCHALL M A，et al. Primary CD4+ T-cell responses provide both helper and cytotoxic functions during Epstein-Barr virus infection and transformation of fetal cord blood B cells [J]. J Virol，2007，81（9）：4766-4775.

[2]SCHERRENBURG J，PIRIOU E R，NANLOHY N M，et a1. Detailed analysis of Epstein-Barr virusspecific CD4+ and CD8+ T cell responses during infectious mononucleosis [J]. Clin Exp Immunol，2008，153（2）：231-239.

[3]FUJIWARA S，KIMURA H，IMADOME K，et al.Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan [J]. Pediatr Int，2014，56（2）：159-166.

[4]任淑红，王强，房俊，等. 儿童传染性单核细胞增多症T细胞亚群及B细胞的动态变化研究[J]. 中华妇幼临床医学杂志（电子版），2009，5（5）：466-469.

[5]邢燕，宋红梅，李太生，等. 慢性活动性EB病毒感染外周血淋巴细胞免疫亚群变化特征的研究[J]. 中华儿科杂志，2009，47（6）：441-445.

[6]BALFOUR H H Jr，HOLMAN C J，HOKANSON K M，et al. A prospective clinical study of Epstein-Barr virus and host interactions during acute infectious mononucleosis [J]. J Infect Dis，2005，192（9）：1505-1512.

[7]ITO Y，SUZUKI M，KAWADA J，et al. Diagnostic values for the viral load in peripheral blood mononuclear cells of patients with chronic active Epstein-Barr virus disease [J]. J Infect Chemother，2016，22（4）：268-271.

[8]OKANO M，KAWA K，KIMURA H，et a1.Proposed guidelines for diagnosing chronic active Epstein-Barr virus infection[J]. Am J Hematol，2005，80（1）：64-69.

[9]YASUTOMO K. The cellular and molecular mechanism of CD4+/CD8+ lineage commitment[J]. J Med Invest，2002，49（1-2）：1-6.

[10]LADELL K，DORNER M，ZAUNER L，et al.Immune activation suppresses initiation of lytic Epstein-Barr virus infection [J]. Cell Microbiol，2007，9（8）：2055-2069.

[11]YAJIMA M，IMADOME K，NAKAGAWA A，et al. A new humanized mouse model of Epstein-Barr virus infection that reproduces persistent infection，lymphoproliferative disorder，and cell-mediated and humoral immune responses [J]. J Infect Dis，2008，198（5）：673-682.

[12]PARK S，KO Y H. Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorders[J]. J Dermatol，2014，41（1）：29-39.

[13]K A R A J A N N I S M A，H U M M E L M，ANAGNOSTOPOULOS I，et a1. Strict lymphotropism of Epstein-Barr virus during acute infectious mononucleosis in nonimmunocompromised individuals[J]. Blood，1997，89（8）：2856-2862.

[14]SILINS S L，SHERRITT M A，SILLERI J M，et a1. Asymptomatic primary Epstein-Barr virus infection occurs in the absence of blood T-cell repertoire perturbations despite high levels of systemic viral load [J]. Blood，2001，98（13）：3739-3744.

[15]HOSHINO Y，NISHIKAWA K，ITO Y，et a1.Kinetics of Epstein-Barr virus load and virus-specif i c CD8+ T cells in acute infectious mononucleosis[J]. J Clin Virol，2010，50（3）：244-246.

[16]谢静，王焕玲，邱志峰，等. 成人传染性单核细胞增多症和慢性活动性EB病毒感染外周血淋巴细胞亚群分析[J]. 中华内科杂志，2016，55（6）：455-459.

[17]茅君卿，杨世隆，宋华，等. 儿童慢性活动性EB病毒感染临床及实验室检查特征 [J]. 中国当代儿科杂志，2014，16（11）：1081-1085.