布地奈德协同辛伐他汀对慢性阻塞性肺疾病大鼠并发动脉粥样硬化的治疗机制

慢性阻塞性肺疾病（COPD）与心脑血管疾病关系密切。Sin等［1］研究发现，COPD不但是心血管病的并发症，而且是心血管疾病发生的独立危险因素。临床观察显示，与正常人相比，COPD患者发生动脉粥样硬化（AS）更早，且气道阻塞程度越重，外周动脉硬化越严重［2］，其机制可能与全身炎性反应、内皮功能障碍和氧化应激等有关［3-4］。

在注册阶段完成后，传感器和密钥生成中心进行相互认证。首先，传感器使用加密算法对公钥Ks、随机数Rs、时间戳T和请求服务内容M进行加密，并将结果ES发送给证书中心。然后，证书中心用私钥K′s对加密信息ES进行解密，验证时间戳的准确性并判断传感器的真实性。最后，如果传感器信息为真实可靠的，则再用公钥Ks加密请求服务内容M和随机数Rs；否则，终止服务。

吸入性糖皮质激素能减轻COPD患者气管和全身炎性反应，他汀类药物除具有降脂作用外亦可降低COPD患者全身炎性因子水平［5］，但两者联合能否对COPD伴发AS患者具有协同影响，目前尚不明确。本研究使用布地奈德联合辛伐他汀干预COPD大鼠模型，通过观察AS相关炎性因子和冠状动脉组织病理变化，探讨ICS联合他汀类药物对COPD大鼠伴发AS的可能影响机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，体质量200～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［实验动物生产许可证号：SCXK（京）2006-0009］。

1.2 主要仪器和试剂

H-600IV型透射电镜（日本日立公司），RM2016型病理切片机（德国徕卡公司），有机玻璃烟熏箱（80 c m×60 c m×50 c m），超声雾化器（鱼跃牌，型号402 AI），脂多糖（德国SIGMA公司），基质金属蛋白酶-9（MMP-9）兔多克隆抗体（批号ab38898，英国ABCA M公司），基质金属蛋白酶抑制剂-1（TI MP-1）兔多克隆抗体（批号NBP1-96554，美国Novus Biologicals公司），大鼠白介素-6（IL-6）ELISA试验盒（货号 HS60B）、C反应蛋白（CRP）ELISA试验盒（货号HS12B）、白细胞介素-8（IL-8）ELISA试验盒（货号 HS61B）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试验盒（货号 HS16B）、白三烯 B4（LTB4）ELISA试剂盒（货号HS24B）购自威斯腾生物公司，娇子牌香烟（四川中烟集团），辛伐他汀片（默沙东制药有限公司），吸入用布地奈德混悬液（阿斯利康制药有限公司）。

与正常对照组相比，其余4组肺组织中MMP-9蛋白表达均明显增加（P均＜0.05）；与M组相比，BD组、SV组和BD＋SV组肺组织中MMP-9蛋白表达均明显降低（P均＜0.05），与BD组、SV组相比，BD＋SV组大鼠肺组织中MMP-9蛋白表达仍明显降低（P均＜0.05），见表3。各组大鼠肺组织MMP-9蛋白免疫组织化学检测结果见图3。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与取材 50只SPF级大鼠，适应性饲养10 d后随机分为正常对照（N组）、模型组（M组）、布地奈德组（BD组）、辛伐他汀组（SV组）和布地奈德+辛伐他汀组（BD+SV组），每组10只。除正常对照组外，其余各组大鼠乙醚麻醉后用耳镜插入喉口，以静脉套管针向气管内注入300μg脂多糖（1 g／L），待大鼠苏醒后转入烟熏箱内进行烟熏，每次14支香烟，时间持续1 h，2次／d，2次烟熏间隔4 h，共计60 d。正常对照组大鼠气管内滴入等量生理盐水，不做烟熏处理。从试验第15 d开始，BD组雾化吸入布地奈德气雾剂0.5 mg／kg，15 min／次，2次／d；SV组剂量灌胃给予辛伐他汀生理盐水5 mg·mg-1·d-1；BD+SV组5 mg·kg-1·d-1灌胃辛伐他汀，同时雾化吸入布地奈德0.5 mg／kg，15 min／次，2次／d。同时接受BD组和SV组处理。

我们发现，Painless DPN组较Non-DPN组左侧丘脑局部一致性减低。丘脑是除嗅觉外所有感觉传至大脑皮层的集中部位，是皮质下感觉的最后中继站，起到重要的感觉加工和信号调制功能［21］。有研究表明［22］，维持丘脑神经元功能可能是糖尿病患者感知神经性疼痛症状的先决条件。本研究中，Painless DPN组丘脑局部神经元活动降低，提示丘脑神经功能受损，这也许可以解释为何部分DPN患者不出现神经性疼痛症状。

1.2.1.2 成立在职培训管理组:由区护士长任组长,指定护理组长一对一带教;根据CSSD制定的岗前培训计划,专人负责,落实到位。

1.3.4 组织MMP-9和TI MP-1检测 取适量大鼠肺组织，采用免疫组化染色SP法、平均光密度法测定肺组织中MMP-9、TI MP-1的蛋白表达水平。

1.3.3 肺和冠状动脉组织HE染色 取肺组织和冠状动脉（取近心端0.5 c m处血管段1 c m），经10%中性甲醛固定48 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色。

1.4 统计学分析

用SPSS 17.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差表示，组间采用单因素方差分析，方差齐者组间进行LSD检验，方差不齐者进行Tamhane′s T2检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2.3.1 肺组织HE染色 正常对照组大鼠呼吸道及肺泡上皮结构完整、形态清晰，肺泡组织形态均匀、肺泡间质厚薄适当，肺泡区极少见到巨噬细胞，支气管腔中几乎没有分泌物和炎性细胞，见图1A。M组大鼠支气管纤毛柱状上皮细胞部分剥脱，纤毛粘连、倒伏、变性和坏死，有的纤毛明显脱落，黏膜下层及肌层大量炎性细胞浸润，同时可见与细支气管伴行的非小动脉炎症，内膜增生肥厚，见图1B。BD组、SV组大鼠以上受损表现较M组有所减轻，见图1C和1D。BD+SV组大鼠肺泡结构完整，部分肺泡壁变薄，肺泡表面积减少，肺泡壁组织密度减低，肺泡孔扩大，但较M组、BD组及SV组肺气肿形成的囊腔变小、各级支气管炎症较轻，见图1E。

4.3.3 颗粒物浓度监测季节变化。从图13～图18可以看出，颗粒物浓度主要是在冬季和秋季较高，夏季颗粒物浓度最低的峰谷峰的变化形式，其中PM10会出现春季峰值的情况。

1.3.2 血清学指标检测 在实验第60 d，以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后，将其仰卧固定于操作台，分离腹主动脉，抽取动脉血5 mL，离心分离血清，采用全自动生化分析仪测定血清总胆固醇（TC）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），计算动脉粥样硬化指数（AI）=（TC-HDL-C）／HDL-C。ELISA法测定CRP、IL-6、IL-8、LTB4、TNF-α的水平。

2 结果

2.1 各组AI比较

与正常对照组相比，其余4组AI均明显升高，M组AI最高（P均＜0.05）；与 M组相比，BD组、SV组和BD+SV组大鼠AI均明显降低，BD+SV组AI最低（P均＜0.05）；与BD和SV组相比，BD+SV组大鼠AI仍明显降低（P均＜0.05），见表1。

 

表1 各组大鼠AI比较

  

注：与正常对照组相比，（1）p＜0.05；与 M 组相比，（2）p＜0.05；与BD组相比，（3）p＜0.05；与SV组相比，（4）p＜0.05

 

06 M 组 8 2.41±0.12（1）BD 组 9 1.47±0.10（1）（2）SV 组 8 1.56±0.08（1）（2）BD＋SV 组 10 0.58±0.03（1）（2）（3）（4）AI正常对照组 10 0.26±0.组别 n

2.2 各组大鼠血清炎性因子水平比较

2.3.2 冠状动脉HE染色 正常对照组大鼠冠状动脉3层结构完整，外膜、中膜、内膜分界清楚，内皮细胞无增生及脱落，内膜厚薄均匀，未见泡沫细胞堆积，外膜未见炎性细胞浸润，见图2 A。M组大鼠冠状动脉切片可见内膜细胞增生及内皮下出现淡染的空泡细胞，有些部分可见中膜平滑肌细胞增生、排列紊乱或呈隆起斑块状结构，有明显的钙化形成，钙化区周围出现泡沫样细胞，见图2B。BD组和SV组大鼠冠状动脉可见内膜增厚，局部存在斑块，内皮细胞轻度肿胀、变性减轻，其下有泡沫细胞堆积，斑块隆起有所减轻，见图2C和2D。与M组、BD组及SV组相比，BD＋SV组大鼠冠状动脉内膜相对较平整，内膜增生及斑块形成程度明显降低。见图2E。

 

表2 各组大鼠血清炎症因子水平比较

  

注：与正常对照组相比，（1）p＜0.05；与 M 组相比，（2）p＜0.05；与BD组相比，（3）p＜0.05；与SV组相比，（4）p＜0.05

 

组别 n CRP／μg·L－1 IL-6／ng·L－1 IL-8／ng·L－1 LTB4／μg·L－1 TNF-α／ng·L－1 65 M 组 8 33.28±4.09（1） 10.90±0.22（1） 241.28±15.23（1） 556.65±38.45（1） 215.56±12.76（1）BD组 9 21.45±5.27（1）（2） 6.79±0.49（1）（2） 175.37±9.65（1）（2） 448.33±20.18（1）（2） 176.69±7.68（1）（2）SV组 8 25.48±3.76（1）（2） 7.42±0.97（1）（2） 188.02±10.23（1）（2） 489.48±29.34（1）（2） 175.37±9.93（1）（2）BD＋SV 组 10 16.47±5.32（1）（2）（3）（4）4.55±0.86（1）（2）（3）（4） 127.76±8.89（1）（2）（3）（4）370.55±16.23（1）（2）（3）（4） 114.62±8.23（1）（2）（3）（4）正常对照组 10 13.87±1.18 2.62±0.64 104.56±9.87 302.45±24.54 98.45±8.

2.3 各组大鼠肺组织和冠状动脉HE染色结果

参照2001年版《医院感染诊断标准（试行）》［3］卫医发[2001]号进行医院感染诊断。采用医院感染实时监控系统软件对发生的医院感染病例进行统计，将资料进行汇总分析。

  

图1 各组大鼠肺组织HE染色结果（×100）

与正常对照组相比，其余4组CRP、IL-6、IL-8、LTB4和TNF-α水平均明显升高，M组最高（P均＜0.05）；与 M 组相比，BD组、SV组和BD+SV组大鼠炎性因子水平均明显降低，BD+SV组最低（P均＜0.05）；与BD和SV组相比，BD+SV组大鼠炎性因子水平仍明显降低（P均＜0.05），见表2。

  

图2 各组大鼠冠状动脉HE染色结果（×100）

2.4 肺组织MMP-9和TIMP-1免疫组化检测结果

（1）变量选取。根据上文的理论分析，本文选择了以下变量：内部控制评价主体、内部控制缺陷发现及整改、内部控制评价报告真实性及会计稳健性，具体变量定义如表1所示：

 

表3 各组大鼠肺组织MMP-9水平比较／OD值

  

注：与正常对照组相比，（1）p＜0.05；与 M 组相比，（2）p＜0.05；与BD组相比，（3）p＜0.05；与SV组相比，（4）p＜0.05

 

组别 n MMP-9 019 M 组 8 0.68±0.078（1）BD组 9 0.47±0.032（1）（2）SV 组 8 0.43±0.026（1）（2）BD＋SV 组 10 0.32±0.017（1）（2）（3）（4）正常对照组 10 0.22±0.

  

图3 各组大鼠肺组织MMP-9免疫组化检测结果（×100）

与正常对照组相比，其余4组大鼠肺组织中TI MP-1蛋白表达均明显减少（P均＜0.05）；与 M组相比，BD组、SV组和BD＋SV组肺组织中TI MP-1蛋白表达均明显增加，BD＋SV组大鼠肺组织中TI MP-1蛋白表达最高（P均＜0.05）；与BD组和SV组相比，BD＋SV组仍明显增加（P均＜0.05），见表4。各组肺组织TI MP-1蛋白免疫组织化学检测结果见图4。

 

表4 各实验组大鼠肺组织TI MP-1水平比较／OD值

  

注：与正常对照组相比，（1）p＜0.05；与 M 组相比，（2）p＜0.05；与BD组相比，（3）p＜0.05；与SV组相比，（4）p＜0.05

 

组别 n TI MP-1 04 M 组 8 0.22±0.02（1）BD 组 9 0.33±0.02（1）（2）SV 组 8 0.36±0.02（1）（2）BD＋SV 组 10 0.47±0.02（1）（2）（3）（4）正常对照组组 10 0.51±0.

  

图4 各组大鼠肺组织TI MP-1免疫组化检测结果（×100）

3 讨论

COPD是一种全身炎性反应性疾病，对动脉硬化病变的发生发展有促进作用。COPD患者血中CRP水平升高是系统炎症的反映，且急性加重期比缓解期升高明显［6］，这在本实验中得到证实。M组大鼠血清CRP升高后，AI急剧上升，动脉钙化和斑块加重，由此可以推测，AS的发生和发展与COPD呈正相关。

在慢性炎症过程中，CRP可以诱发内皮细胞表达黏附因子和化学趋化因子，激活单核细胞释放炎性因子，导致AS和血栓形成［7］。大量研究表明，CRP可通过上调黏附分子和趋化因子的表达，促进内皮细胞发生炎性反应［8］。本实验研究发现，发生COPD后，大鼠血清CRP、IL-6、IL-8、TNF-α、LTB4等炎性因子和肺部 MMP-9水平明显升高，肺部TI MP-1水平明显降低，从而加重了血管内皮细胞的炎性反应，结果与文献报道一致。

吸入性糖皮质激素可降低稳定期COPD患者的血清CRP水平，提示吸入糖皮质激素有减轻全身炎性反应的作用。研究发现，吸入糖皮质激素可降低COPD患者的死亡率。Huiart等［9］发现，COPD患者吸入糖皮质激素后，发生急性心肌梗死的风险减少18%～32%。一项根据随机对照试验进行的荟萃分析表明，吸入糖皮质激素的COPD患者较对照组死亡率降低27%，而死亡率的降低不排除是由于COPD患者心血管疾病的死亡率降低所致，故可以假设吸入性糖皮质激素有利于降低血管炎症和加强斑块的稳定性［10］。

辛伐他汀可通过降低 MMP-1、MMP-9水平，升高TI MP-1水平和平衡 MMP-9／TI MP-1的比例，抑制气道和肺组织中的慢性炎性反应，延缓COPD的发展进程，起到一定的治疗作用［11］。Søyseth等［12］发现，使用他汀类药物与COPD急性加重期患者生存率的提高相关，联用吸入性糖皮质激素更有利于改善患者预后。而调脂治疗对于COPD患者的AS是否有干预作用尚需要进一步研究证实。

本研究可初步得到以下结论：布地奈德联合辛伐他汀对COPD并发AS有明显作用，其机制可能是二者多靶点、多途径协同作用的结果，即布地奈德通过抑制肺部CRP表达，减少了下游炎性因子的释放，从而减轻血管内皮细胞炎性反应；辛伐他汀则通过降低血管内皮细胞MMP等的表达，保护性抑制内皮细胞的炎性反应。本研究为COPD患者动脉粥样硬化的预防和治疗提供了联合用药的理论依据。

参 考 文 献

［1］ Sin DD，Man SF.Chr onic obstr uctive pul monary disease：a novel risk factor f or cardiovascular disease［J］.Can J Physiol Phar macol，2005，83（1）：8-13.

［2］ 叶利水.慢性阻塞性肺疾病对冠状动脉粥样硬化性心脏病患者心功能的影响［J］.中 国药物经济 学，2016，11（6）：115-116.

［3］ Lee T M，Lin MS，Chang NC，et al.Usef ul ness of C-reactive protein and interleukin-6 as predictors of outcomesin patients with chr onic obstr uctive pul monary disease receiving pravastatin［J］.Am J Cardiol，2008，101（4）：530-535.

［4］ Boaz M，Cher nin G，Sch wartz I，et al.C-reactive protein and car otid and femoral inti ma media t hickness：predicting inflammation［J］.Clin Nephrol，2013，80（6）：449-455.

［5］ Lawes CM，Thornley S，Young R，et al.Statin usein COPD patients is associated wit h a reduction in mortality：a national cohort study［J］.Pri m Care Respir J，2012，21（1）：35-40.

［6］ Emer ging Risk Fact ors Collaboration， Kaptoge S， Di Angelantonio E，et al.C-reactive protein concentration and risk of coronary heart disease，stroke，and mortality：an individual participant meta-analysis［J］.Lancet，2010，375（9709）：132-140.

［7］ Gr uf man H，Goncalves I，Edsfeldt A，et al.Plas ma levels of high-sensitive C-reactive pr otein do not correlate wit h inflammatory activity in carotid atherosclerotic plaques［J］.Inter n Med，2014，275（2）：127-133.

［8］ Dietel B，Cicha I，Voskens CJ，et al.Decreased nu mbers of regulator y T cells are associated wit h hu man at her oscleroticlesion vulnerability and inversely correlate wit h infiltrated mature dendritic cells［J］.Atherosclerosis，2013，230（1）：92-99.

［9］ Huiart L，Er nst P，Ranouil X，et al.Lo w-dose inhaled corticoster oids and t he risk of acute myocar dial infarction in COPD［J］.Eur Respir J，2005，25（4）：634-639.

［10］ Berkius J，Engerström L，Or welius L，et al.A prospective longitudinal multicentre study of health related quality of life in ICU sur vivors wit h COPD［J］.Crit Care，2013，17（5）：R211.

［11］ 熊萍，黄炎明，左万里，等.辛伐他汀对慢性阻塞性肺疾病大鼠基质金属蛋白酶及炎症因子表达的影响［J］.中国呼吸与危重监护杂志，2015，14（6）：541-545.

［12］ Søyset h V，Brekke PH，Smit h P，et al.Statin use is associated wit h reduced mortalit y in COPD［J］.Eur Respir J，2007，29（2）：279-283.