过表达骨形态发生蛋白-4对小鼠诱导性多能干细胞生物学活性的影响

通过成体细胞中高表达4种特殊转录因子（Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc）而生成的诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）可用来产生间充质干细胞（mesenchyma stem cells，MSCs），并在特定的微环境下，定向诱导成所需的细胞进行组织修复。这些细胞由于有助于牙及牙周组织的再生与修复而在牙科领域中具有广阔的应用前景[1]。骨形态发生蛋白-4（bone morphogenetic protein-4，BMP4）作为转化生长因子（transforming growth factor，TGF）家族重要的一员，在脊椎动物的牙发育过程中广泛表达并发挥了重要的作用。尽管目前有多种诱导人类胚胎干细胞以及iPS细胞牙向分化的方法，但效果并不显著。本研究通过在iPS细胞中过表达BMP4，观察内源性BMP4的表达增加对iPS生物学增殖和牙向分化能力的影响，探索其潜在的临床治疗价值。     

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠iPS-C5细胞株购自中国科学院广州生物医药健康研究院。胎牛血清、高糖DMEM、非必需氨基酸、丙醇酸钠（Gibco公司，美国），2-巯基乙醇、白血病抑制因子、BMP4（Sigma公司，美国），CCK8试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP ）活性试剂盒（南京建成生物工程研究所），荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（宝生物工程大连有限公司），Trizol RNA抽提试剂盒（生工生物工程上海股份有限公司）。

1.2 胚体（embryoid body，EB）的培养、诱导与慢病毒转染 

小鼠脑膜来源的iPS-C5细胞接种、传代前，预先准备好丝裂霉素C灭活处理过的小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）作为滋养层，iPS-C5细胞培养在滋养层细胞以及0.1%明胶的细胞培养皿中。培养条件为37 ℃、5%CO2的饱和湿度培养箱，每天换液1次，每2天传代1次。将消化下来的iPS-C5细胞吹打至单个细胞，用无白细胞抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）的iPS培养液作为EB培养液悬浮培养2 d，差度离心收集培养的EB，并培养在含有成釉细胞无血清条件培养液、铺有0.1%明胶的培养皿内，待细胞贴壁后第2天，根据Inamura等[2]的转染步骤进行慢病毒转染。本实验所用的慢病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司提供（基因名称：BMP4；物种：小家鼠；基因ID：12159；Genbank：NC_000080.6）。实验分为3组：1）空白组：未作任何转染的细胞；2）空载体组：转染慢病毒阴性对照组的细胞；3）BMP4过表达组：转染过表达BMP4慢病毒的细胞。

1.3 CCK8检测细胞增殖活性

3组细胞按相同的密度2×103个·mL-1接种于铺有0.1%明胶的96孔板内，每组3个平行孔，细胞在成釉细胞无血清条件培养液中分别培养1、2、3、4、5、6、7 d后，弃去上清液，每孔加入10 μL CCK-8溶液和90 μL PBS，轻微振荡混匀后继续孵育1  h，测定450 nm波长下的吸光度A值，重复实验3次。

我不明就理地转过头盯着李小树，只见他说完这句话后就把眯着的眼睛合闭上了。他抿了抿嘴无比享受地说：“你有没有感觉得到它的柔滑与细致？”

1.4 ALP活性检测细胞分化程度

3组细胞按相同的密度1×104个·mL-1接种于铺有0.1%明胶的6孔板内，每组3个平行孔，细胞在成釉细胞无血清条件培养液中连续培养7 d，每孔加50 μL Triton X-100裂解细胞，收集上清液，并用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，用ALP活性测定试剂盒测定ALP水平。

1.5 荧光定量PCR检测牙向分化相关基因的表达

3组细胞按相同的密度1×104个·mL-1接种于铺有0.1%明胶的6孔板内，每组3个平行孔，细胞在成釉细胞无血清条件培养液连续培养7 d后，收集并检测BMP4、成釉细胞蛋白（ameloblastin，AMBN）、细胞角蛋白（cytokeratin，CK）14、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）、骨细胞特异转录因子Runx2的mRNA表达。Trizol裂解并提取iPS细胞总RNA。测定RNA浓度，分别反转录为cDNA。逆转录所得cDNA利用Syber Green荧光定量PCR检测试剂盒进行荧光定量PCR检测，目的基因及管家基因在不同的反应管中进行扩增，反应体系均为201 μL，引物序列见表1。反应条件：95 ℃变性20 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40个循环。实时荧光定量PCR仪读取数据。

说明：CAM，摄像头；IVAS，智能网络视频分析服务器；VMS，视频分析管理服务器；EMS，电子地图系统；ISCA，人工智能视频监控客户端应用；ISCC，人工智能视频监控客户端；NVRS，网络视频存储服务器；SDU，信号及数据管理服务单元；DBS，数据库服务器。

 

表1 引物基因序列Tab1 Gene sequence of primers

  

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1.6 统计学分析 

随着企业集团之间的竞争日趋激烈，实施多元化战略转型已经是大势所趋，但是多元化战略能否保证企业的持续盈利并降低财务风险呢？下面本文针对乐视集团的经营战略进行分析。

2 结果

2.1 BMP4 mRNA的表达

[4]  Liu L, Wei X, Huang R, et al. Effect of bone morphogenetic protein-4 on the expression of Sox2, Oct-4, and c-Myc in human periodontal ligament cells during long-term culture[J]. Stem Cells Dev, 2013, 22(11):1670-1677.

  

图1 iPS-C5细胞光学显微镜× 1600Fig1 iPS-C5 cells optical microscope× 1 600

2.2 细胞增殖活性

过表达BMP4组、空载体组、空白组的ALP活性分别为60、45、45 U·g-1。统计分析表明，过表达BMP4组的ALP活性高于空载体组和空白组（P＜0.05），提示过表达BMP4能促进细胞的分化能力。

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据之间的比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 

 

表2 转染7 d后3组的Runx2、AMBN、CK14、DSPP、BSP mRNA表达Tab2 Expression of Runx2, AMBN, CK14, DSPP, BSP mRNA in 3 groups in 7 d after transfection

  

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图2  CCK8检测细胞增殖活性Fig  2  Cell proliferation activity detected by CCK8

3 讨论

2.3 ALP活性 

CCK8检测细胞增殖活性结果见图2。统计分析表明，转染后第1、2天，过表达BMP4组的细胞增殖活性与空载体组和空白组相比无统计学差异；转染后第3~7天，过表达BMP4组的细胞增殖活性均高于空载体组和空白组（P＜0.05），这表明过表达BMP4能够显著促进细胞的增殖活性。

2.4 牙向分化相关基因的表达

荧光定量PCR检测转染7 d后3组的Runx2、AMBN、CK14、DSPP、BSP mRNA的表达见表2。统计分析表明，与空白组及空载体组相比，过表达BMP4组Runx2、AMBN、CK14、DSPP、BSP mRNA的表达增加（P＜0.05）。

观察组患者治疗过程中共出现1例恶心现象，对照组患者治疗过程中出现4例恶心以及2例呕吐情况；因此观察组患者不良反应发生率1例（2.9%）显著低于对照组患者6例（17.1%）。

BMPs属于转化生长因子β超家族的成员，在调节干细胞自我更新过程中发挥着多种作用，并参与多种器官的发育过程。BMPs参与了EB细胞的自我更新和分化，可诱导人类EB或iPS的增殖和分化。作为诱导胚胎发育的关键因素，BMPs可能与ES或iPS细胞分化成三个胚层并与细胞最终命运密切相关[5,8]。本课题组前期研究[1]发现，外源性的BMP4能促进iPS细胞的牙向分化，那么内源性的BMP4表达增加，将会对iPS的生物学活性产生什么影响？本实验的主要研究目的是明确过表达BMP4即增加内源性BMP4的表达对iPS生物学增殖和牙向分化能力的影响，探索其潜在的临床治疗能力。首先，本研究在实验方法上进行了改进，用无LIF的iPS培养液作为EB培养液悬浮培养2 d，差度离心收集培养的EB，培养在成釉细胞无血清条件培养液中，成釉细胞无血清条件培养液实际上已成为培养EB的微环境，并具有诱导分化的作用。待细胞贴壁后，实际上是已分化的iPS，在此基础上，对iPS进行稳定转染。本研究结果表明，过表达BMP4能够促进细胞的增殖活性及ALP活性。成釉细胞无血清条件培养液本身就有对iPS诱导分化的作用，过表达BMP4使得这种促进作用更为明显。在关于牙向分化的实验中，本研究发现，稳定转染7 d后，过表达BMP4组Runx2、AMBN、CK14、DSPP、BSP mRNA的表达高于空载体组和空白组。AMBN、CK14的主要功能是在牙胚发育中参与釉质基质形成和矿化过程，并影响胶原纤维和牙本质基质的合成。DSPP、BSP与促进成牙本质细胞分化、促进分泌基质矿化、类牙本质基质及牙髓牙本质复合体样等结构形成关系密切，是成骨相关的重要矿化因子。Runx2作为骨和牙齿发育过程中的一个重要转录因子，在牙齿发育的早期阶段呈现高表达状态，并参与了牙冠形成和成牙本质细胞分化。本研究结果更加能从内源性的角度说明BMP4对iPS细胞诱导分化的重要性。过表达BMP4能促进Runx2、AMBN、CK14、DSPP、BSP的表达，对促成牙本质的效果似乎更加明显，其促进牙向分化的能力是可以被肯定的。

Liu L, Wang HL, Chen ZL, et al. Bone morphogenic protein 4-induced odontogenic differentiation of mouse induced pluripotent stem cells[J]. Chin J Geriatr Dent, 2014, 12(9):259-261.

[参考文献]

[1]  刘丽, 王红雷, 陈增力, 等. 骨形态发生蛋白-4对小鼠诱导性多能干细胞牙向分化能力的影响[J]. 中华老年口腔医学杂志, 2014, 12(9):259-261.

选择该院收治的大肠癌合并糖尿病围手术期患者108例，随机分为对照组和研究组，各54例，对照组：男患38例，女患16例，年龄51～73岁，平均年龄(62.4±5.8)岁，结肠癌 39例，直肠癌15例；研究组：男患 36例，女患 18 例，年龄 52～75 岁，平均年龄(63.7±5.9)岁，结肠癌38例，直肠癌16例，排除心脏、肾、肺功能衰竭者，两组患者基础资料差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

[2]  Inamura M, Kawabata K, Takayama K, et al. Efficient generation of hepatoblasts from human ES cells and iPS cells by transient overexpression of homeobox gene HEX[J]. Mol Ther, 2011, 19(2):400-407.

[3]  Requicha JF, Viegas CA, Muñoz F, et al. A tissue Engineering approach for periodontal regeneration based on a biodegradable double-layer scaffold and adipose-derived stem cells[J]. Tissue Eng Part A, 2014, 20(17/18):2483-2492.

转染BMP4慢病毒的iPS-C5细胞见图1。实时荧光定量PCR结果显示，空白组、空载体组、BMP4过表达组BMP4 mRNA的相对表达量分别为0.444±0.800、0.507±0.100、0.817±0.064。统计分析表明，与空白组及空载体组相比，BMP4过表达组BMP4 mRNA的表达升高（P＜0.05）。这说明，iPS-C5细胞转染BMP4慢病毒后BMP4 mRNA水平升高。

由于生物三维结构的复杂性和不同组织结构的多样性，如必要的血管化、神经支配和细胞外基质沉积使得器官和组织的修复与再生变得十分困难。干细胞能启动牙齿组织再生的潜能，可能是牙源性细胞再生修复的一种治疗方法[3-4]。iPS技术能产生可以用于特定的患者或特定的疾病的细胞，可以提供无限制的干细胞库，从而减少了胚胎材料的伦理争议。iPS是可自遗传的，因此避免了与胚胎干细胞有关的伦理和免疫学方面的问题。此外，自体iPS还大大减少了免疫排斥的机会，并且具有高度的生物相容性[5-6]。iPS的数目可以很容易地扩大，为临床应用提供无限的细胞来源。目前，从人类已分化好的牙源性细胞通过逆转录病毒而得到的iPS可用来产生MSCs。这些诱导产生出来的MSCs增殖能力甚至比固有的MSCs还要高，与之相比，大大提高了生物安全性和细胞扩张的优势，而且iPS相对容易获得和处理，非常适合应用于口腔组织和器官组织再生[7]。

[5]  Thein Han W, Liu J, Tang M, et al. Induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cell seeding on biofunctionalized calcium phosphate cements[J]. Bone Res, 2013, 1(4):371-384.

[6]  刘丽, 李亚静, 赵文峰. 小鼠诱导性多能干细胞向牙源性细胞分化的实验研究[J]. 中华老年口腔医学杂志, 2014, 12(1):48-52.

Liu L, Li YJ, Zhao WF. Experimental study on the differentiation of mouse induced pluripotent stem cells to odontogenic cells[J]. Chin J Geriatr Dent, 2014, 12(1):48-52.

[7]  Egusa H, Okita K, Kayashima H, et al. Gingival fibroblasts as a promising source of induced pluripotent stem cells[J]. PLoS ONE, 2010, 5(9):e12743.

[8] Lian Q, Zhang Y, Zhang J, et al. Functional mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells attenuate limb ischemia in mice[J]. Circulation, 2010, 121(9):1113-1123.

在生猪养殖中，要求养殖人员定期做好猪场的清理消毒工作，对于蜱虫以及吸血蝇等体位寄生虫的生长也需要进行严格的控制，这样也就能有效减少ASFV病毒的传播途径，以获得良好的ASF防治效果。此外，还需要不断加强对我国兽医工作者的培训工作，需要加强对出入境检查免疫结构跟风险度比较高的国家以及相关人员的培训工作，使这些检疫人员对于ASF的判断能力得到进一步的提升，以避免携带有ASFV病毒的产品或者生猪进入到我国市场。环境条件也是影响到ASF病症发生的重要因素，在进行生猪的养殖中，要求相关养殖人员能做好养殖环境的调节工作，避免因应激反应导致的生猪免疫力降低等问题[3]。